LP(a)對(duì)小鼠骨髓源性?xún)?nèi)皮祖細(xì)胞損傷作用的初步研究.pdf

1、目的：初步探討心血管疾病獨(dú)立危險(xiǎn)因子脂蛋白（a）[LP（a）]對(duì)小鼠骨髓源性?xún)?nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）的損傷作用及其可能的機(jī)制。
　　方法：實(shí)驗(yàn)分為6組：①對(duì)照組，加等量含200μmol/L EDTA的全培養(yǎng)液；②1μg/ml的LP（a）處理組，③10μg/ml LP（a）處理組，④100μg/ml的LP（a）處理組，⑤300μg/ml LP（a）處理組，⑥600μg/ml LP（a）處理組。貼壁法分離與培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs），攝

2、取ac-LDL和結(jié)合UEA-1鑒定EPCs，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活與增殖，transwell測(cè)定細(xì)胞遷移，明膠粘附法測(cè)定EPCs的粘附，基質(zhì)膠上種植EPCs，photshop7.0計(jì)算血管長(zhǎng)度，顯微鏡下觀測(cè)單個(gè)細(xì)胞克隆大小和克隆數(shù)目，RT-PCR和western blotting分別檢測(cè)一氧化氮合酶（eNOS）的mRNA水平和蛋白表達(dá)情況，細(xì)胞免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)eNOS蛋白在EPCs的表達(dá)和分布情況，并采用DCFH-DA染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)

3、活性氧（ROS）的量，采用Griess試劑法測(cè)定一氧化氮（NO）水平。
　　結(jié)果：①采用貼壁法能從小鼠鼠骨髓的單個(gè)核細(xì)胞中分離出純度達(dá)70％以上的EPCs。②LP（a）劑量依賴(lài)性影響 EPCs存活，100μg/ml LP（a）開(kāi)始對(duì) EPCs產(chǎn)生一定的破壞作用，300μg/ml LP（a）對(duì)EPCs的破壞作用急速加大。③1μg/ml LP（a）即能顯著抑制EPCs的遷移，當(dāng)LP（a）濃度達(dá)到10μg/ml時(shí)，遷移到下槽的細(xì)胞數(shù)目大

4、大減少，其遷移細(xì)胞數(shù)不到對(duì)照組的1/6，LP（a）濃度為100μg/ml時(shí)，其遷移細(xì)胞數(shù)減少到對(duì)照組的1/9，300μg/ml時(shí)其遷移細(xì)胞數(shù)約為對(duì)照組的1/14。④LP（a）劑量依賴(lài)性抑制 EPCs的粘附。1μg/ml的LP（a）可明顯減少EPCs粘附細(xì)胞數(shù)目（145.2±8.4個(gè)/每個(gè)視野 vs115.2±12.6個(gè)/每個(gè)視野，P＜0.05，n=5），當(dāng) LP（a）的濃度達(dá)到10μg/ml時(shí)，EPCs粘附能力進(jìn)一步下降，下降到對(duì)照組的

5、1/2，當(dāng)LP（a）的濃度達(dá)到100μg/ml時(shí)下降到對(duì)照組的約1/3，當(dāng)LP（a）的濃度達(dá)到300μg/ml時(shí)，EPCs粘附能力下降最顯著，其下降到對(duì)照組的約1/16。⑤ EPCs經(jīng)10μg/ml LP（a）處理后，血管形成能力的明顯受到損傷，當(dāng)LP（a）的濃度增加到100μg/ml時(shí)，EPCs的血管形成能力大大減弱，已經(jīng)不到對(duì)照組的1/4（36.34±1.54mm/每個(gè)視野 vs8.76±0.62mm/每個(gè)視野，P＜0.001，n=

6、5）；當(dāng) LP（a）的濃度增加到300μg/ml時(shí)，差不多已經(jīng)見(jiàn)不到完整的血管樣結(jié)構(gòu)。⑥經(jīng)100μg/ml的LP（a）處理后，不但克隆數(shù)目明顯減少（10.2±1.3 vs3.1±0.4，P＜0.01，n=5），而且克隆生長(zhǎng)明顯受到抑制。⑦機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)： EPCs經(jīng)過(guò)100μg/ml的LP（a）處理后，eNOS mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，一氧化氮（NO）顯著減少（36.35±3.91 vs3.91±0.79，P＜0.001，n=3）。

7、活性氧檢測(cè)結(jié)果表明，在1μg/ml LP（a）作用下，活性氧產(chǎn)生顯著增加（1±0.12 vs3.92±0.36，P＜0.05，n=5）；當(dāng)LP（a）的濃度為10μg/ml時(shí)，熒光強(qiáng)度是對(duì)照組的近15倍；當(dāng) LP（a）的濃度為100μg/ml時(shí)，與前述各組相比較，胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度和發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞均增多（圖12D），其熒光強(qiáng)度是對(duì)照組的31倍多，是1μg/ml LP（a）的近8倍，是10μg/ml LP（a）的2倍多。
　　結(jié)論: