G-CSF動(dòng)員自體骨髓源性細(xì)胞對(duì)博萊霉素所致小鼠肺損傷的治療作用探討.pdf

1、骨髓源性細(xì)胞(BMDCs)包含有多種類型的骨髓干細(xì)胞。粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)可以動(dòng)員BMDCs進(jìn)入血液循環(huán)，并且BMDCs可以向其它類型的組織細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)擬用G-CSF動(dòng)員BMDCs入血，并觀察其對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的肺損傷的修復(fù)作用和機(jī)制。 第一部分實(shí)驗(yàn)小鼠的骨髓重建 目的： 用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記BMDCs，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中BMDCs在體內(nèi)的示蹤研究做準(zhǔn)備。 方法： 20只C57BL

2、/6J小鼠隨機(jī)分為2組，每組10只，A組為移植組(全身照射+骨髓移植)；B組為對(duì)照組(全身照射)。兩組分別給予致死劑量照射后，A組接受GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓移植，B組不予移植。觀察指標(biāo)：(1).存活和體重變化情況；(2).外周血白細(xì)胞數(shù)量；(3).實(shí)驗(yàn)第28天時(shí)骨髓細(xì)胞中GFP表達(dá)情況。 結(jié)果： (1).對(duì)照組小鼠在照射后體重明顯下降，并在照射后11天內(nèi)陸續(xù)死亡；移植組小鼠體重在照射后一周內(nèi)出現(xiàn)輕微下降而后逐漸恢復(fù)正常，

3、僅有2只小鼠在11天內(nèi)死亡； (2).對(duì)照組小鼠外周血白細(xì)胞在第5天時(shí)降為零，移植組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)量在照射后第5天明顯下降，但在28天時(shí)恢復(fù)至正常水平。 (3).實(shí)驗(yàn)第28天時(shí)移植組存活小鼠的骨髓細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞檢測(cè)GFP陽(yáng)性比例與GFP轉(zhuǎn)基因小鼠相當(dāng)。 結(jié)論：骨髓移植后小鼠存活率可達(dá)80％，重建后的骨髓細(xì)胞帶有GFP標(biāo)記，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 第二部分骨髓重建后小鼠自體BMDCs動(dòng)員對(duì)博萊霉素所致肺損傷的

4、影響 目的： 觀察G-CSF動(dòng)員自體BMDCs入血，以及對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺損傷的修復(fù)作用。 方法： 60只骨髓重建后的小鼠隨機(jī)分為兩組，每組各30只，A組為動(dòng)員組(博萊霉素+G-CSF)；B組為對(duì)照組(博萊霉素+生理鹽水)。每組再各分為3個(gè)亞組，分別在實(shí)驗(yàn)第3、7和14天處死取材。觀察項(xiàng)目包括： (1).肺組織病變?nèi)庋巯麓篌w觀察： (2).肺組織病理切片在光學(xué)顯微鏡下觀察： (

5、3).Masson三聯(lián)染色觀察肺組織內(nèi)膠原沉積； (4).免疫組化方法檢測(cè)肺組織內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)，包括：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、干擾素-γ(IFN-γ)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和金屬蛋白酶組織抑制物-1(TIMP-1)； (5)肺組織內(nèi)羥脯氨酸含量的測(cè)定； (6).肺組織內(nèi)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)情況。 結(jié)果： (1).兩組小鼠的肺組織在肉眼觀察下無(wú)明顯差異； (2).肺組

6、織病理切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，A組小鼠在第7天時(shí)炎癥程度明顯輕于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在第3和第14天時(shí)差異不明顯； (3).肺組織Masson染色結(jié)果顯示，A組小鼠在第3和第7天時(shí)肺內(nèi)膠原沉積明顯低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。在第14天時(shí)差異不明顯； (4).A組小鼠肺組織內(nèi)TGF-β1的表達(dá)在第3和第7天時(shí)明顯低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)； (5).A組小鼠肺組織

7、內(nèi)IFN-γ的表達(dá)在第3天時(shí)明顯低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)； (6).A組小鼠肺組織內(nèi)MMP-9的表達(dá)在第7和第14天時(shí)明顯低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)： (7).兩組小鼠肺組織內(nèi)TIMP-1的表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯差異； (8).A組小鼠肺組織內(nèi)羥脯氨酸的含量在第7天時(shí)明顯低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)； (9).流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，A組小鼠肺組織內(nèi)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例

8、在第7天時(shí)最高，而且與B組小鼠相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)； (10).A組小鼠在第3天和第7天時(shí)，肺組織冰凍切片內(nèi)均可觀察到綠色熒光細(xì)胞存在。B組在實(shí)驗(yàn)觀察的各時(shí)間點(diǎn)均未觀察到有明顯的綠色熒光細(xì)胞存在。 結(jié)論： G-CSF動(dòng)員BMDCs對(duì)博萊霉素所致的肺損傷有一定的保護(hù)作用，可能與肺內(nèi)有一定數(shù)量的BMDCs聚集和下調(diào)肺內(nèi)致纖維化因子相關(guān)。 第三部分非骨髓重建小鼠自體BMDCs動(dòng)員對(duì)博萊霉素所致肺

9、損傷的影響 目的： 觀察粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)動(dòng)員自體BMDCs對(duì)博萊霉素所致的小鼠肺損傷的修復(fù)作用及機(jī)制探討。 方法： 75只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為三組，C組為動(dòng)員組，n=30，(博萊霉素+G-CSF)；D組為對(duì)照組，n=30，(博萊霉素+生理鹽水)；N組為正常組，n=15，(生理鹽水代替博萊霉素)。每組再各分為3個(gè)亞組，分別在實(shí)驗(yàn)第3、7和14天處死取材。觀察項(xiàng)目包括： (1)

10、.肺組織病變?nèi)庋巯麓篌w觀察； (2).肺組織病理切片在光學(xué)顯微鏡下觀察； (3).Masson三聯(lián)染色觀察肺組織內(nèi)膠原沉積： (4).免疫組化方法檢測(cè)肺組織內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)； (5).肺組織內(nèi)羥脯氨酸含量的測(cè)定； (6).肺通透指數(shù)(LPI)：支氣管肺泡灌洗液(BALF)蛋白含量/血清蛋白含量。另將20只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為兩組，動(dòng)員組(E組)10只，(博萊霉素+G-CSF)；對(duì)照組(F組)

11、10只，(博萊霉素+生理鹽水)。兩組不設(shè)終點(diǎn)，觀察小鼠的存活時(shí)間。 結(jié)果： (1).C組和D組小鼠的肺組織在肉眼觀察下無(wú)明顯差異； (2).肺組織病理切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，C組小鼠在第7天時(shí)炎癥程度明顯輕于D組(p<0.05)； (3).肺組織Masson染色結(jié)果顯示，C組小鼠在第7天時(shí)肺內(nèi)膠原沉積明顯低于D組（p<0.05)； (4).C組小鼠肺組織內(nèi)TGF-β1的表達(dá)在第3、7和14天時(shí)明顯

12、低于D組（p<0.05)； (5).C組小鼠肺組織內(nèi)IFN-γ的表達(dá)在第3和第7天時(shí)明顯低于D組(p<0.05)； (6).C組小鼠肺組織內(nèi)MMP-9的表達(dá)在第7天時(shí)明顯低于D組(p<0.05)； (7).C組和D組小鼠肺組織內(nèi)TIMP-1的表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯差異； (8).C組小鼠肺組織內(nèi)羥脯氨酸的含量在第7天時(shí)明顯低于D組(p<0.05)； (9).C組小鼠肺通透指數(shù)在第3和第7天時(shí)與D組