西他列汀手性胺生物催化工藝研究.pdf

1、西他列汀作為一種治療Ⅱ型糖尿病的手性胺藥物，療效好、副作用小，具有良好的市場前景。西他列汀的合成主要有化學(xué)法和生物法，與西他列汀化學(xué)合成法相比，生物催化制備西他列汀具有綠色環(huán)保、產(chǎn)品光學(xué)純度高等優(yōu)點(diǎn)。本文對(duì)生物催化制備西他列汀所使用的ω-轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行了初步改造，并優(yōu)化了制備工藝。
　　本文首先于Gene Bank獲得公開的ω-轉(zhuǎn)氨酶ATA-117基因序列，構(gòu)建E.coliBL21/pET28a-ATA-117工程菌，驗(yàn)證其轉(zhuǎn)氨活性。

2、使用鄰苯二甲胺二鹽酸作為顯色氨基供體，驗(yàn)證了通過平板培養(yǎng)基上菌落顯色反應(yīng)指示轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的可行性，并以此構(gòu)建了平板顯色的高通量篩選方法。
　　對(duì)模板ω-轉(zhuǎn)氨酶ATA-117的124、126、150、152位氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，獲得了T126L(41.0％)，T126N(31.1％)，S150Y(23.6％)，T126F(20.5％)，S152I(10.7％)五個(gè)有利突變，并以T126L為基礎(chǔ)，對(duì)其余突變的疊加效果進(jìn)行了研究。

3、>　　探索了突變株T126L的最佳發(fā)酵條件，最佳誘導(dǎo)劑濃度為IPTG1.0mM，最佳誘導(dǎo)溫度為35℃，最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為OD6000.64左右（發(fā)酵時(shí)間5h左右），最佳誘導(dǎo)時(shí)長為12h。在最佳發(fā)酵條件下，收集細(xì)胞后凍干，最終酶活可達(dá)6321U/g。隨后在30L發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵突變株T126L，發(fā)酵結(jié)束OD600達(dá)到115.432。
　　以突變株T126L替代ATA-117，優(yōu)化生物催化制備西他列汀工藝，優(yōu)化后的反應(yīng)條件為:助溶劑DM