重組人骨形成蛋白成熟肽-4對(duì)輻射小鼠骨髓造血損傷修復(fù)作用初探.pdf

1、骨形成蛋白(BoneMorphogeneticProteins，BMPs)是一種分泌型糖蛋白，具有多種生物學(xué)功能。BMP2和BMP4是骨形成蛋白家族中的兩個(gè)重要成員，在結(jié)構(gòu)和功能上這兩種蛋白都非常相似，兩者都能夠誘導(dǎo)骨組織的生成和造血組織的分化等，但BMP2誘導(dǎo)骨組織形成的活性更強(qiáng)，BMP4則對(duì)造血組織的作用更突出。在成體，BMP2誘導(dǎo)異位骨形成，成為用于骨組織工程的重要誘導(dǎo)因子；BMP4則可以促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)造血干細(xì)胞向紅

2、系、粒系和巨噬細(xì)胞系三系細(xì)胞分化，從而能夠促進(jìn)受損傷的造血系統(tǒng)的全面再生與恢復(fù)；這些特性使得BMP2和BMP4都具有很好的臨床應(yīng)用前景。 在BMP的制備過(guò)程中，真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量低，表達(dá)產(chǎn)物回收、純化困難、生產(chǎn)成本很高；原核表達(dá)系統(tǒng)，特別是大腸桿菌系統(tǒng)，具有表達(dá)效率高，容易操作，容易監(jiān)控，產(chǎn)物穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，故而我們?cè)谶M(jìn)行BMP的大規(guī)模制備過(guò)程中選擇了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。目前，重組人骨形成蛋白2的大規(guī)模制備已有較多報(bào)道，本

3、研究的目的，就是應(yīng)用我們目前已經(jīng)比較成熟的制備BMP2的工藝，來(lái)制備BMP4，來(lái)驗(yàn)證大規(guī)模制備這兩種蛋白時(shí)，能否用相同的發(fā)酵程序及相近的純化方法。 兩種工程菌株(DH5α/pDH2-BMP-4m及DH5α/pDH2-BMP-2m)分別含有能夠高表達(dá)人骨形成蛋白成熟肽(Bonemorphogeneticproteinmaturepeptide，hBMP-m)hBMP-4m和hBMP-2m的質(zhì)粒，分別導(dǎo)入15升NBS發(fā)酵罐中進(jìn)行恒溶

4、氧高密度發(fā)酵和誘導(dǎo)表達(dá)，測(cè)定發(fā)酵菌液OD600值分別為30.8和32.3。離心收集菌體，PAGE電泳后光密度掃描表明hBMP-4m占細(xì)菌總蛋白量的42％，hBMP-2m占細(xì)菌總蛋白量的47.2％。懸浮所收集的菌體，裂菌，洗滌4次后的包涵體中hBMP-4m占蛋白量的82.9％，hBMP-2m占蛋白量的84.5％。預(yù)先取少量樣品進(jìn)行探索實(shí)驗(yàn)后，全部包涵體分別用8M尿素緩沖液溶解，上SepharoseSP-FF陽(yáng)離子柱，分別收集0.35MNa

5、Cl和0.2MNaCl洗脫部分，獲得純度為96％的hBMP-4m及純度為95％的hBMP-2m。其收獲量分別為1.3g/L發(fā)酵液和1.25g/L發(fā)酵液；收得率分別為34.33％和34.81％。結(jié)果表明大規(guī)模制備hBMP-4m,及hBMP-2m時(shí)，可以使用相同的發(fā)酵程序及相近的純化方法，都能夠得到較好的收得率、較高的收獲量和純度。 將經(jīng)過(guò)上述大規(guī)模制備的rhBMP-4m和rhBMP-2m在不使用任何吸附載體的情況下、分別直接植入小

6、鼠肌肉中，結(jié)果都在局部生成骨組織，這整體動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)兩者都是具備成骨活性的，這更進(jìn)一步證明了我們的制備及純化方法是行之有效的。在動(dòng)物試驗(yàn)過(guò)程中，rhBMP-4m和rhBMP-2m表現(xiàn)出了不同程度的誘導(dǎo)骨形成的能力，其中，rhBMP-2m的誘骨能力最強(qiáng)，第2周就有骨小梁形成；而rhBMP-4m的成骨能力較弱，至第4周方始形成軟骨。 BMP4已被證實(shí)是一種造血調(diào)控因子，有研究指出，其在低濃度時(shí)可促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖和分化，高濃度時(shí)則

7、可促進(jìn)造血干細(xì)胞再生能力的提高，從而促骨髓增殖能力更持久，說(shuō)明BMP4對(duì)造血干細(xì)胞的存活有直接影響。 骨髓造血細(xì)胞對(duì)射線(xiàn)敏感，輻射能夠直接致死骨髓造血細(xì)胞或誘導(dǎo)骨髓造血細(xì)胞發(fā)生凋亡，引起造血干細(xì)胞數(shù)量下降。CD34抗原是是一種階段特異性白細(xì)胞分化抗原，選擇性表達(dá)于人類(lèi)造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面。CD34+細(xì)胞則是非均質(zhì)的細(xì)胞群，其中既含有造血干細(xì)胞也存在不同分化階段的造血祖細(xì)胞。因此，CD34表面抗原的檢測(cè)是能夠反映骨

8、髓造血的狀況的指標(biāo)之一，對(duì)造血干細(xì)胞的確認(rèn)、計(jì)數(shù)、分離和控制具有重要價(jià)值。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)BMP2能夠提高輻射小鼠的存活率，并對(duì)輻射小鼠骨髓造血功能的恢復(fù)具有促進(jìn)作用；但是BMP4對(duì)輻射小鼠是否具有類(lèi)似作用，目前尚無(wú)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)觀察重組人骨形成蛋白成熟肽-4對(duì)輻射小鼠骨髓造血功能的促進(jìn)作用，為骨形成蛋白治療輻射引起的骨髓造血損傷提供一定的依據(jù)。 1.建立小鼠骨髓型急性放射損傷的動(dòng)物模型，分離和純化骨髓單個(gè)核細(xì)胞，確定本課題研究的基本

9、方法。通過(guò)60Coγ射線(xiàn)照射昆明小鼠，照射劑量7Gy，吸收劑量率為1.45Gy/rain，建立小鼠骨髓型急性放射損傷的動(dòng)物模型；制備骨髓細(xì)胞懸液，利用Ficoll密度梯度離心法，分離、純化骨髓單個(gè)核細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量的變化。結(jié)果，小鼠受到輻射后，骨髓單個(gè)核細(xì)胞數(shù)與正常組相比，有非常顯著的差別(P＜0.01)，經(jīng)重組人骨形成蛋白成熟肽-4治療后，骨髓單個(gè)核細(xì)胞數(shù)高于照射組(P＜0.05)。 2.重組人骨形成蛋白成熟肽-4對(duì)輻射小鼠

10、外周血白細(xì)胞變化的影響。小鼠受到60Coγ射線(xiàn)照射后，經(jīng)rhBMP-4m治療，檢測(cè)外周血白細(xì)胞數(shù)。結(jié)果：輻射后小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)與正常組相比，有非常顯著的差別(P＜0.01)，經(jīng)重組人骨形成蛋白成熟肽-4治療后，外周血白細(xì)胞數(shù)高于照射組(P＜0.01)。 3.重組人骨形成蛋白成熟肽-4對(duì)輻射小鼠骨髓CD34+細(xì)胞變化的影響。小鼠受到60Coγ射線(xiàn)照射后，經(jīng)rhBMP-4m治療，利用流式細(xì)胞儀(FCM)，檢測(cè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CD3

11、4+細(xì)胞比例，比較對(duì)照組和治療組之間的差別。結(jié)果：骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞所占比例明顯低于正常組(P＜0.01)：經(jīng)重組人骨形成蛋白成熟肽-4治療后，骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞所占比例高于照射組(P＜0.05)。 4.重組人骨形成蛋白成熟肽-4對(duì)輻射小鼠脾臟表面CFU-S形成的影響。小鼠受到60Coγ射線(xiàn)照射后，經(jīng)rhBMP-4m治療后，于第9天解剖并取出其脾臟組織，用固定液固定24h后，觀察其脾臟表面，發(fā)現(xiàn)治療組脾臟

12、表面生成有較多的結(jié)節(jié)(CFU-S)，而對(duì)照組很少。結(jié)果：治療組小鼠脾結(jié)節(jié)數(shù)及脾體比均明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。 5.重組人骨形成蛋白成熟肽-4對(duì)輻射小鼠30天存活率的影響。小鼠受到60Coγ射線(xiàn)照射后，rhBMP-4m治療組30天存活率為35％；而對(duì)照組存活率僅10％。治療組明顯高于對(duì)照組。 本課題的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠經(jīng)60Coγ射線(xiàn)照射后，骨髓造血功能受到損傷，通過(guò)重組人骨形成蛋白成熟肽-4治療，能夠促進(jìn)骨髓單個(gè)