鈍齒棒桿菌產(chǎn)L-精氨酸供氧策略優(yōu)化的初步研究.pdf

1、L—精氨酸是人體和動物體內(nèi)的半必需堿性氨基酸，是合成蛋白質(zhì)肌酸的重要原料，也是生物體尿素循環(huán)的一種重要中間代謝產(chǎn)物，具有多種獨(dú)特的生理和藥理作用。L—精氨酸在臨床醫(yī)藥、食品、化妝品以及有關(guān)生物研究領(lǐng)域中用途廣泛，導(dǎo)致市場對其需求量正不斷增加。 溶氧對于好氧發(fā)酵生產(chǎn)L—精氨酸來說，既是營養(yǎng)因素，又是環(huán)境因素，對菌體的生長和產(chǎn)物的形成都有重要影響。解決氧需求問題通常有兩種方法：一是提高發(fā)酵過程中的溶氧水平，另一途徑則是利用基因工程技

2、術(shù)來提高細(xì)胞自身對氧氣的利用率。本論文即將分別從這兩方面優(yōu)化L—精氨酸發(fā)酵的供氧策略。 論文以鈍齒棒桿菌CorynebacteriumcrenatumSYPA5—5為研究菌株，通過控制不同供氧條件的試驗，考察發(fā)酵過程中供氧對L—精氨酸合成的影響。不同供氧條件下的L—精氨酸發(fā)酵特性的研究結(jié)果表明，發(fā)酵生產(chǎn)L—精氨酸對供氧有較高的要求，在發(fā)酵過程中需要消耗大量的氧氣來維持細(xì)胞代謝和L—精氨酸的合成，氧的供應(yīng)不足會嚴(yán)重抑制L—精氨酸的

3、合成。 對不同供氧條件下該菌株代謝流量分配進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)：高供氧(HOS)條件下，L—精氨酸的產(chǎn)量得到了提高。但是，在發(fā)酵的后半階段，中供氧(MOS)比高供氧(HOS)更有利于穩(wěn)定的L—Arg積累。因此，提出了兩步法供氧控制策略，該策略先在發(fā)酵的初始階段維持HOS條件，然后控制攪拌轉(zhuǎn)速穩(wěn)步下降，以維持一個穩(wěn)定的溶氧改變。運(yùn)用新的供氧策略后，L—精氨酸的產(chǎn)量達(dá)到36.6g/L，比HOS和MOS分別增加了16％和51％，而且，葡萄糖

4、的消耗速率的明顯增加，發(fā)酵周期僅為81h，比HOS條件下提前了6h。 C.crenatumSYPA5—5是革蘭氏陽性工業(yè)用菌株，尚未見鈍齒棒桿菌的遺傳表達(dá)體系的研究報道。本論文以氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)作為報告基因，成功構(gòu)建了含有不同啟動子的重組表達(dá)質(zhì)粒，并對其在大腸桿菌和鈍齒棒桿菌中的啟動子活性進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌和鈍齒棒桿菌中啟動子強(qiáng)度最大的都是tac啟動子，lacZ次之，T7啟動子強(qiáng)度最小，且T7在鈍齒棒

5、桿菌中不具有啟動子功能。因而，確定下一步實驗所用啟動子為tac。 在此基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了攜帶有來源于透明顫菌血紅蛋白基因vgb的表達(dá)質(zhì)粒pJCl-tac—vgb，并分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109和鈍齒棒桿菌SYPA5—5。利用CO差光譜法對重組菌表達(dá)的透明顫菌血紅蛋白進(jìn)行了活性及定量檢測。并對重組菌SYPA5—5(pJCl-tac—vgb)的發(fā)酵特性進(jìn)行了初步分析。結(jié)果顯示，發(fā)酵過程中不加IPTG的重組菌的菌濃比原始菌提高了10.9