大腸桿菌核黃素中下游合成途徑的改造及生產(chǎn).pdf

1、本文圍繞大腸桿菌(Escherichia coli)核黃素生物合成的中下游途徑，以E.coli K-12 MG1655為出發(fā)菌株進(jìn)行代謝工程改造。通過改造核黃素生物合成基因和嘌呤生物合成途徑中的關(guān)鍵基因，逐步提高核黃素的生物合成。
　　本研究首先對(duì)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和E.coli中的核黃素生物合成途徑的相關(guān)基因進(jìn)行過表達(dá)。同時(shí)構(gòu)建了過表達(dá)B. subtilis和E.coli核黃素操縱子的質(zhì)粒p20C

2、-Bsrib和p20C-EC10，分別轉(zhuǎn)化到野生型E. coli中，構(gòu)建了菌株RF01B和RF01S。經(jīng)搖瓶發(fā)酵，菌株RF01B生產(chǎn)了200.5 mg/L核黃素，菌株RF01S生產(chǎn)了225.1 mg/L核黃素。結(jié)果表明，過表達(dá)大腸桿菌自身的核黃素生物合成基因?qū)它S素的積累更有效。因此，選取 RF01S菌株進(jìn)行下一步地基因工程改造。
　　在過量表達(dá)核黃素生物合成基因以后，核黃素生物合成的直接前體物--3,4-二羥基-2-丁酮4-磷酸

3、(DHBP)和GTP的有效利用可能是核黃素生物合成的限制因素。因此，以RF01S作為出發(fā)菌株，通過提高ribB基因的表達(dá)和改造嘌呤生物合成途徑來增加前體物的供給，進(jìn)而提高核黃素的產(chǎn)量。首先，通過替換強(qiáng)啟動(dòng)子的方式過表達(dá)ribB基因來增加5-磷酸核酮糖到DHBP的通量。其次，依然通過替換強(qiáng)啟動(dòng)子的方式對(duì)ndk和gmk基因進(jìn)行過表達(dá)來提高GTP的供給。然后，在purA基因中引入突變點(diǎn)來減少分支途徑IMP到AMP的通量。最后，過表達(dá)突變的pu