益生菌和抗生素對刺參(Apostichopus japonicus)生長、免疫及腸道菌群影響的比較研究.pdf

1、本論文以我國北方沿海重要的珍貴經(jīng)濟養(yǎng)殖品種刺參（Apostichopusjaponicus）為研究對象，在室內(nèi)循環(huán)養(yǎng)殖水系統(tǒng)進行攝食生長實驗，以探究飼料中添加益生菌（馬氏副球菌（Paracoccus marcusii DB11）、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus G19)）和抗生素（氟苯尼考）對刺參生長、腸道組織結(jié)構(gòu)、腸道菌群組成、非特異性免疫及其相關(guān)基因表達的影響，在此基礎(chǔ)上探討刺參腸道細菌微生物網(wǎng)絡(luò)響應(yīng)益生菌和抗生素投喂，

2、腸道組織和體腔細胞非特異性免疫的調(diào)控機制及兩者之間的聯(lián)系。本文的研究內(nèi)容和主要研究結(jié)果如下:
　　1、益生菌和抗生素對刺參生長、消化及腸道組織結(jié)構(gòu)影響的比較研究
　　本研究旨在探究飼料中添加馬氏副球菌(P.marcusii DB11，109 cfu/kg-d)、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus G19，109 cfu/kg-d）和氟苯尼考（15 mg/kg，施藥5d后停藥15d，20 d一個周期）對刺參（初重，4.68±0.3

3、6 g）的生長、消化和腸道組織結(jié)構(gòu)的影響以及三者之間的相互聯(lián)系。每個處理分別設(shè)置5個重復(fù)，以投喂未添加上述任何成份的基礎(chǔ)飼料組作為空白對照，養(yǎng)殖實驗周期為60 d。實驗結(jié)果表明，在馬氏副球菌組和蠟樣芽孢桿菌組刺參的特定生長率顯著性高于對照組（P＜0.05），氟苯尼考組刺參的生長與對照組不存在顯著性差異(P＞0.05)。刺參的生長與營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收緊密聯(lián)系。研究結(jié)果顯示，馬氏副球菌組中粗蛋白表觀消化率最高，顯著高于蠟樣芽孢桿菌組和對照

4、組(P＜0.05)，而其在蠟樣芽孢桿菌組和氟苯尼考組均與對照組不存在顯著性差異(P＞0.05)。在光學(xué)顯微鏡水平條件下可以觀察到，蠟樣芽孢桿菌組刺參中腸皺褶高度和微絨毛高度均顯著高于對照組(P＜0.05)，腸道的吸收表面積顯著性增加，進而有效增強腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收;氟苯尼考組的腸道內(nèi)微絨毛高度顯著性低于對照組（P＜0.05），吸收面積驟降。通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，馬氏副球菌組微絨毛表面存在大量粘液，而氟苯尼考組刺參腸道內(nèi)的微絨毛大幅萎縮，腸

5、上皮細胞甚至出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，該結(jié)果表明氟苯尼考的頻繁使用可能會增加病原菌的入侵的風(fēng)險。
　　2、益生菌和抗生素對刺參非特異性免疫指標影響的比較研究
　　高密度養(yǎng)殖過程中病害頻發(fā)，抗生素大量被使用，引起水產(chǎn)動物免疫力下降，導(dǎo)致存活率降低。而益生菌日常使用不僅可以促進水產(chǎn)動物的生長，還可以增強其免疫力而提高存活率，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。本研究旨在比較飼料中添加益生菌（馬氏副球菌（P.marcusii DB11）和蠟樣芽孢桿菌(

6、B.cereus G19))和抗生素（氟苯尼考）對刺參體腔細胞非特異性免疫的影響，測定的指標包括:吞噬活性、呼吸爆發(fā)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)和超氧化物歧化酶(SOD)。實驗結(jié)果表明，投喂馬氏副球菌可以顯著性提高刺參體腔細胞的吞噬活性、呼吸爆發(fā)和超氧化物歧化酶活性（P＜0.05）;投喂蠟樣芽孢桿菌顯著性提高了刺參體腔細胞的吞噬活性、呼吸爆發(fā)和堿性磷酸酶活性（P＜0.05）;而投喂氟苯尼考的刺參體腔細胞

7、的呼吸爆發(fā)能力顯著性低于對照組（P＜0.05），但溶菌酶活力顯著性高于對照組(P＜0.05);刺參體腔細胞的酸性磷酸酶不受飼料變更的影響（P＞0.05）。綜上所述，投喂馬氏副球菌和蠟樣芽孢桿菌可以顯著性提高刺參的非特異性免疫力，而氟苯尼考組是截然相反的結(jié)果。
　　3、飼喂益生菌和抗生素刺參體腔注射滅活燦爛弧菌前后相關(guān)免疫基因表達的比較研究
　　研究證明飼料中添加益生菌（馬氏副球菌（P.marcusii DB11）和蠟樣芽孢桿

8、菌（B.cereus G19））可以有效提高刺參的非特異性免疫，而抗生素（氟苯尼考）會降低刺參的非特異性免疫，但具體的免疫調(diào)節(jié)機制仍不清楚。本文通過研究刺參腸道中腸組織NF-κB信號通路中Aj-p105、Aj-p50和Aj-rel三個轉(zhuǎn)錄因子基因和溶菌酶基因Aj-lys mRNA表達來探究馬氏副球菌、蠟樣芽孢桿菌和氟苯尼考調(diào)節(jié)刺參非特異性免疫的機制，以及刺參體腔注射滅活燦爛活菌后上述4個免疫基因在體腔細胞中的表達情況，從分子轉(zhuǎn)錄水平反映

9、益生菌和抗生素刺參抗病力的影響。研究結(jié)果顯示，在刺參腸道組織中，投喂馬氏副球菌顯著提高了Aj-p105、Aj-p50和Aj-lys mRNA的表達（P＜0.05），增幅分別為50％、49％和47％;投喂蠟樣芽孢桿菌對Aj-p105、Aj-p50和Aj-rel mRNA的表達沒有顯著影響（P＞0.05），但Aj-lys mRNA的表達顯著性低于對照組（P＜0.05），僅為對照組的54％;投喂氟苯尼考顯著性抑制了腸道組織中Aj-p50、Aj

10、-rel和Aj-lys mRNA的表達（P＜0.05)，表達量分別為對照組的62％、32％和37％。刺參體腔注射滅活燦爛弧菌后，四個處理組體腔細胞Aj-p105 mRNA的表達24 h內(nèi)均大幅下降，最終趨于平穩(wěn);Aj-p50 mRNA在蠟樣芽孢桿菌組表達量急劇增加并在第24 h首先達到峰值，而其余三個處理組在第72 h達到峰值，隨后全部下降并趨于平穩(wěn);在0到24 h，Aj-rel mRNA的表達在蠟樣芽孢桿菌組的表達均顯著性高于對照組，

11、而其在馬氏副球菌組和氟苯尼考組的表達在第24 h時顯著高于對照組;Aj-lys mRNA在對照組和氟苯尼考組的表達均是的先上升后下降，分別在第24 h和72 h處達到峰值，其在蠟樣芽孢桿菌組的表達在24 h后持續(xù)大幅增加，并在第7d顯著性高于其它三個處理組（P＜0.05）。上述研究結(jié)果表明，馬氏副球菌可以通過調(diào)節(jié)免疫基因Aj-p105、Aj-p50和Aj-lys mRNA來提高刺參腸道非特異性免疫。在注射滅活燦爛弧菌后，蠟樣芽孢桿菌組刺

12、參體腔細胞的Aj-p50 mRNA表達迅速達到峰值表明，投喂蠟樣芽孢桿菌可能通過調(diào)控NF-κB信號通路中轉(zhuǎn)錄因子的表達來調(diào)節(jié)刺參的非特異性免疫，使其在更短的時間內(nèi)對入侵的病原菌作出應(yīng)激反應(yīng)，然后再通過分泌溶菌酶進一步清除病原菌。
　　4、益生菌和抗生素對刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)影響的比較研究
　　通過Illumina MiSeq高通量測序平臺測定了細菌16S DNA V3-V4區(qū)來研究刺參腸道細菌微生物群落組成及物種之間的相互作用響

13、應(yīng)日糧中添加馬氏副球菌(P.marcusii DB11)、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus G19）和間歇添加氟苯尼考，以投喂未作添加的基礎(chǔ)飼料的刺參作為對照組。研究結(jié)果顯示，在門分類水平上，刺參腸道內(nèi)的細菌分布在36個不同的細菌類群，主要由變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和疣微菌門(Verrucomicrobia)組成。在綱分類水平上，四個處理組的刺參腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群均為黃桿菌綱(Flav

14、obacteriia)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)和α-變形菌綱，但在各處理組中的相對豐度存在差異。它們在對照組中的相對豐度依次為49％、18％和16％。黃桿菌綱在對照組中是第一優(yōu)勢菌群，它的豐度在其它三個處理組都有不同程度的下降，主要是黃桿菌科(Flavobacteriaceae)細菌的豐度下降引起。馬氏副球菌組的疣微菌綱(Verrucomicrobiae)（主要是疣微菌Verrucomicrobiacea

15、e）的豐度大幅增加（從5％增至14％），同時黃桿菌綱的豐度大幅下降（降至29％，第一優(yōu)勢菌群）;蠟樣芽孢桿菌組中的α-變形菌綱(主要是紅菌科Rhodobacteraceae)成為第一優(yōu)勢菌群（增至36％），然而黃桿菌綱的豐度急劇下降（降至15％）;氟苯尼考組中γ-變形菌綱（主要是弧菌科Vibrionaceae）增至27％，成為第一優(yōu)勢菌群，同時疣微菌綱的豐度也大幅增加（從5％增至12％），而黃桿菌綱的豐度下降至16％，此外氟苯尼考組的細

16、菌多樣性指數(shù)最低?；赨niffac和非Unifrac權(quán)重的PCoA分析結(jié)果顯示，馬氏副球菌組、蠟樣芽孢桿菌組和氟苯尼考組刺參的腸道菌群結(jié)構(gòu)均與對照組發(fā)生明顯分異。生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，飲食可以通過改變刺參腸道細菌微生物群落組成和OTU在網(wǎng)絡(luò)圖中的拓撲角色來影響兩個不同功能微生物種群之間的相互作用，同時腸道細菌微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)組成與腸道菌群結(jié)構(gòu)組成相似。對照組刺參腸道細菌微生物的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)由主要由22個子模塊(sub-module)構(gòu)成，包

17、含563個OTUs和1552條連線，其中有4個OTUs分別屬于連接器（Connectors，3個）和模塊樞紐（Module hubs，1個），同時，各個子模塊之間聯(lián)系緊密。連接器和模塊樞紐在整個生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中承擔(dān)著不可不可或缺的作用。馬氏副球菌組生態(tài)網(wǎng)絡(luò)主要由5個大型的子模塊構(gòu)成，包含682個OTUs和5517條連線，屬于連接器（7個）和模塊樞紐（5個）的OTUs數(shù)量增至12個，OTUs之間和子模塊之間聯(lián)系在四個處理組最緊密。蠟樣芽孢桿菌組