EB病毒Zta-P54蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及檢測(cè)方法的初步探索.pdf

1、Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniVers時(shí)forthedegreeofMasterExpression，PurificationofZta—P54FusionProteininEscherichiacoliofEpstein—BallrVirusAndresearchThedetectionmethodsByChunyanZhangSuperVisor：Prof1YPunlongW

2、angBiochemist巧andMolecularBiologyC01legeoflifesciencesMay2014摘要摘要EB病毒與鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān)，該病毒以環(huán)狀DNA的形式整合在宿主細(xì)胞染色體上。由于鼻咽位置較深，早期病變?cè)谂R床常規(guī)體檢中不容易被發(fā)現(xiàn)，且CT等影像學(xué)診斷很難區(qū)分早期鼻咽癌與其它鼻咽增生性病變。因此，創(chuàng)傷小、成本低、檢測(cè)速度快的血清學(xué)診斷方法是目前鼻咽癌早期診斷研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。鑒于此我們擬通過表達(dá)鼻咽癌BZ

3、LFlBMⅪ71融合基因的蛋白抗原來建立檢測(cè)病人血清中EB病毒相關(guān)抗體，為鼻咽癌的早期診斷及廣譜篩查提供技術(shù)手段。本研究根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室pGEx5TBZLFlBMI強(qiáng)1質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果，利用premer50設(shè)計(jì)引物，從已有EB病毒抗原基因序列的質(zhì)粒上，通過PCR方法擴(kuò)增獲得目的基因片段，與載體pET32a連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a／BZLFlBMI江1，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDSPAGE分析蛋白可溶性、We

4、stenlblot檢測(cè)所表達(dá)蛋白的免疫原性，并通過優(yōu)化的硫酸銨沉淀、離子交換層析和親和層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。辣根過氧化物酶標(biāo)記純化的ZtaP54融合蛋白，利用棋盤法確定重組抗原包被和酶標(biāo)抗體工作濃度，初步建立新的鼻咽癌診斷及篩查ELIsA方法，對(duì)其進(jìn)行特異性、精密性和臨床分析。結(jié)果表明：1)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32彩BzLFlBMI江1實(shí)現(xiàn)了ZtaP54融合蛋白的可溶性表達(dá)；2)建立了該抗原的優(yōu)化純化程序，純度可達(dá)965％；3)利用