紅色亞棲熱菌海藻糖合酶在畢赤酵母中的優(yōu)化表達及酶學性質的研究.pdf

1、海藻糖因具有眾多獨特的生理功能而被廣泛應用于食品加工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、農業(yè)、化妝品產業(yè)等各個領域中。海藻糖合酶能夠通過一步反應直接催化麥芽糖生成海藻糖，產物組成較簡單，不消耗高能物質，原料廉價易得，是工業(yè)化生產海藻糖的好方法。來源于嗜熱菌的海藻糖合酶具有很好的耐熱性，可在較高溫度下反應，能夠有效避免工業(yè)生產過程中的的污染問題，因而備受關注。隨著海藻糖應用范圍日益擴大，獲得一株穩(wěn)定的、表達量高的、適合工業(yè)生產的海藻糖合酶工程菌株成為目前亟待解決

2、的問題。許多來源于真菌、細菌及動植物的海藻糖合酶基因已經克隆得到，并且大部分已在大腸桿菌中成功表達，但目前很少有在酵母等真核表達系統(tǒng)中表達海藻糖合酶的研究報道。
　　 本實驗室在前期工作中克隆得到了來自紅色亞棲熱菌(Meiothermus ruber)CBS-01中的海藻糖合酶基因，并已在大腸桿菌中得到異源表達，該酶的最適反應溫度為50℃，且具有較好的溫度耐受性，有一定的開發(fā)潛力。但由于原核表達體系具有易形成包涵體，產酶量較低，

3、在發(fā)酵生產中易丟失表達質粒等缺陷，不利于該酶的工業(yè)化生產。巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)是二十世紀八十年代發(fā)展起來的一種新型的外源蛋白表達系統(tǒng)，它具有研究背景成熟，表達框穩(wěn)定、操作技術簡單、表達量高、可高密度發(fā)酵生產等優(yōu)越性，迅速成為目前應用最為廣泛、極具發(fā)展前景的表達系統(tǒng)之一。鑒于此，本研究構建了海藻糖合酶的畢赤酵母表達系統(tǒng)，并通過對其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，使紅色亞棲熱菌海藻糖合酶在畢赤酵母中的表達量達到150mg/L，是在大腸桿菌中表達量的30

4、倍，為工業(yè)化發(fā)酵生產海藻糖合酶奠定了良好的實驗理論基礎。
　　 利用Ni-NTA親和層析和陰離子交換色譜法對海藻糖合酶進行了分離純化，獲得了純度很高的蛋白酶，并對其酶學性質進行了較詳細的檢測。結果表明，該酶最適反應溫度為50℃，最適作用pH為6.5，并且對溫度和pH都具有很好的耐受性，在4℃-60℃以及pH5-pH8范圍內耐受60min都能夠保留90％以上的活性。此外，4℃冷藏保存2個月對該酶的活性幾乎不產生影響，說明該酶非常適