來(lái)源于橄欖綠鏈霉菌A1的木聚糖酶XYNB的分子改良.pdf

1、本研究從提高木聚糖酶XYNB的熱穩(wěn)定性入手，通過定點(diǎn)突變和DNAshuffling的方法對(duì)木聚糖酶XYNB進(jìn)行定向改良，將突變酶在畢赤酵母中表達(dá)純化并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，以確定突變效果。同時(shí)，對(duì)該酶的催化殘基、影響最適pH的因素也做了一定的分析。 通過定點(diǎn)突變的方法，獲得了熱穩(wěn)定性有所提高的突變酶N13D、S40E、T11Y、XS和TB。其中，突變酶N13D和S40E在70℃處理5min，熱穩(wěn)定性分別比XYNB提高了24.76

2、％和14.46％；T11Y突變酶在70℃處理10min，熱穩(wěn)定性是XYNB的2.8倍；增加二硫鍵的突變酶XS在70℃的半衰期由XYNB的3min提高到9min；氨基端替換獲得的融合酶TB，熱穩(wěn)定性較XYNB有很大的提高，在70℃的半衰期由XYNB的3min提高到20min。 再對(duì)以上突變位點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化組合，獲得了突變酶TS(氨基端替換結(jié)合二硫鍵的加入)，最終比XYNB在70℃處理20min的熱穩(wěn)定性提高了12.4倍，半衰期由原來(lái)的

3、3min提高到150min.突變酶TS由于具有很好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，在工業(yè)上有較好的應(yīng)用前景。 通過同源建模和定點(diǎn)突變，獲得突變酶E87F、E177F和N46D。突變酶E87F、E177F的酶活性幾乎完全喪失，推斷E87、E177是木聚糖酶XYNB的催化殘基。突變酶N46D的最適pH值由5.2下降到4.2，pH穩(wěn)定性也向酸性pH偏移，同時(shí)，最適溫度和熱穩(wěn)定性也有一定的提高，結(jié)果證實(shí)木聚糖酶XYNB的第46位的氨基酸與其最適

4、pH值相關(guān)，并對(duì)酶的酸堿催化反應(yīng)起重要的作用。 通過DNAshuffling的方法構(gòu)建木聚糖酶XYNB的突變體庫(kù)，定向篩選熱穩(wěn)定性有所提高的突變酶，從700個(gè)表達(dá)菌株中篩選出sh-94＃突變酶，將突變酶基因在畢赤酵母中表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，sh-94＃在70℃的熱穩(wěn)定性較野生型酶XYNB提高了1倍。又篩選到sh-17＃突變酶，它的最適溫度由原酶的60℃下降到40℃，熱穩(wěn)定性有所下降。初步建立了應(yīng)用DNAshuffling的方法對(duì)木聚糖