口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3B優(yōu)勢表位關(guān)鍵位點(diǎn)鑒定與缺失標(biāo)記病毒構(gòu)建.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性動物傳染病，傳播迅速、發(fā)病率高，對發(fā)病地區(qū)的政治和經(jīng)濟(jì)有著巨大負(fù)面影響。傳統(tǒng)滅活疫苗的免疫接種是當(dāng)前預(yù)防和控制FMD最為有效的手段，但免疫后難以與自然感染動物進(jìn)行區(qū)分，致使我國FMD無法得到徹底地控制和凈化，因此需要發(fā)展能夠區(qū)分自然感染和疫苗免疫的FMD標(biāo)記疫苗

2、。為了發(fā)展復(fù)制性能優(yōu)良的FMD標(biāo)記病毒疫苗候選株，本論文進(jìn)行了以下三部分的研究:
　　1.利用丙氨酸掃描的方法成功構(gòu)建了含F(xiàn)MDV rvOZK/93-083B123蛋白以及其突變體的16個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒(S1～S16)，轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，24h后對轉(zhuǎn)染細(xì)胞用實(shí)驗(yàn)室前期篩選、保存的一株抗FMDV3B的單克隆抗體3B4B1進(jìn)行間接免疫熒光和免疫印跡分析。結(jié)果顯示除S12表達(dá)的3B突變蛋白消除了與單抗3B4B1的結(jié)合能力外，其余表達(dá)的

3、3B突變蛋白均能與單抗3B4B1發(fā)生特異性結(jié)合，表明單抗3B4B1識別的FMDV3B蛋白關(guān)鍵氨基酸位于3B1和3B2的2PY-GP6中。
　　2.在已構(gòu)建的FMDV疫苗株pOZK/93-08感染性克隆的基礎(chǔ)上，針對3B1和3B2的2PY-GP6做了一系列突變修飾，構(gòu)建了6株含3B蛋白不同突變的全長重組質(zhì)粒，NotⅠ線化后分別轉(zhuǎn)染表達(dá)T7 RNA聚合酶的BSR/T7細(xì)胞，共拯救到3株重組病毒。將重組病毒以及親本毒株接種BHK-21細(xì)

4、胞后，分別用單抗3B4B1進(jìn)行間接免疫熒光和免疫印跡分析，結(jié)果顯示含3B1和3B2突變(4AGP6→4TAA6)的重組病毒rvO/TAA完全消除了與單抗3B4B1的結(jié)合能力，而其余病毒均能與該單抗發(fā)生特異性結(jié)合。進(jìn)一步分析重組病毒rvO/TAA和親本病毒的一步生長曲線，蝕斑表型以及遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果表明rvO/TAA具有與親本病毒相似的復(fù)制能力和噬斑表型，3B12蛋白的突變(4AGP6→4TAA6)對病毒復(fù)制無明顯影響;rvO/TAA經(jīng)過

5、20次細(xì)胞傳代后，RT-PCR測序顯示突變的氨基酸穩(wěn)定存在。
　　3.成功構(gòu)建含F(xiàn)MDV3B1和3B2突變(4AGP6→4TAA6)的3B蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒，在BL21細(xì)菌中誘導(dǎo)表達(dá)、純化后，連同實(shí)驗(yàn)室保存的FMDV rvOZK/93-083B蛋白進(jìn)行濃縮，并用單抗3B4B1進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果同樣顯示含3B1和3B2突變(4AGP6→4TAA6)的O/TAA-3B蛋白不能與單抗3B4B1發(fā)生特異結(jié)合，而未突變的OZK-3B蛋白能

6、夠與該單抗發(fā)生特異性結(jié)合，說明3B1和3B2的突變(4AGP6→4TAA6)取消了與單抗單抗3B4B1結(jié)合能力。另外經(jīng)ISA201佐劑乳化后分別免疫豚鼠和小鼠制備血清，用實(shí)驗(yàn)室建立的3B阻斷ELISA方法進(jìn)行了初步檢測分析，結(jié)果顯示突變3B蛋白制備的多組血清阻斷值偏高(PI＞50％)，推測其原因在于單抗識別位點(diǎn)的臨近位置存在干擾表位，或是原核表達(dá)蛋白的免疫原性同真核存在差異，表明配套診斷方法仍待進(jìn)一步完善。
　　綜上，本研究成功鑒