口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2B的離子孔道特性研究.pdf

1、病毒離子孔道蛋白(Viroporins)是由病毒編碼的一類小分子量、疏水性跨膜蛋白。它們一般由50-120個氨基酸殘基組成，至少有一個疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域。這些疏水性跨膜區(qū)能夠與宿主細(xì)胞內(nèi)的磷脂雙分子層相互作用并使磷脂雙分子層擴散。離子孔道蛋白參與破壞宿主細(xì)胞的形態(tài)并擾亂宿主細(xì)胞的生理學(xué)功能以保證病毒能夠完成其完整的生命周期。小RNA病毒科腸道病毒屬病毒編碼的2B蛋白具有寡聚化形成跨膜孔道、增加宿主細(xì)胞膜通透性、擾亂宿主細(xì)胞Ca2+體內(nèi)平衡

2、、誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生自噬以及誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的凋亡等viroporin特性。本研究中，以小RNA病毒科腸道病毒屬中的脊髓灰質(zhì)炎病毒和柯薩奇病毒的2B蛋白研究為參考，借鑒多種病毒離子孔道蛋白的研究方法，對口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2B的結(jié)構(gòu)特性和功能展開初步研究。
　　1.運用在線預(yù)測軟件對2B蛋白氨基酸序列進行預(yù)測，結(jié)果顯示，亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒2B基因含有462 bp，總共編碼154個氨基酸。整條肽鏈擁有兩個疏水區(qū)，分別為氨基酸83-104和

3、氨基酸119-137。構(gòu)建pXJ-FLAG-2B，pXJ-2B-HA及pXJ-2B△(110-111)等帶有不同標(biāo)簽的重組質(zhì)粒在BHK-21細(xì)胞中表達(dá)，并采用0.01％ TritonⅩ-100和洋地黃皂苷(0.01mg/mL)對細(xì)胞的處理，確定了2B蛋白的跨膜方式與ⅡA型viroporin的跨膜方式一致。構(gòu)建帶有綠色熒光標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pEGFPN1-2B在BHK-21細(xì)胞中表達(dá)，并采用激光共聚焦顯微鏡的觀察，確定了2B蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

4、構(gòu)建帶有SUMO標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pSMK-2B在大腸桿菌C43(DE3)中表達(dá)并純化，經(jīng)戊二醛作用，2B蛋白單體之間出現(xiàn)了不同程度的寡聚化作用，確定了2B蛋白在細(xì)胞外能夠相互作用;同時，免疫共沉淀實驗顯示，帶有不同標(biāo)簽的2B蛋白單體間出現(xiàn)寡聚化作用，確定了2B蛋白在BHK-21細(xì)胞內(nèi)也能夠相互作用。2B蛋白的這些結(jié)構(gòu)特性與viroporin的一般結(jié)構(gòu)特性相一致。
　　2.通過對比空載體質(zhì)粒pSMK以及重組質(zhì)粒pSMK-2B在大腸桿菌

5、BL21(DE3)和C43(DE3)的表達(dá)以及兩種重組菌株的增殖情況。結(jié)果顯示，2B蛋白只在毒性耐受性更強的大腸桿菌C43(DE3)菌株中表達(dá)，而且與大腸桿菌C43(DE3)相比，大腸桿菌BL21(DE3)的增殖明顯受到抑制。這證明了2B蛋白對原核細(xì)胞有一定的毒性作用。將重組質(zhì)粒pXJ-FLAG-2B或pXJ-2B-HA轉(zhuǎn)入BHK-21細(xì)胞，2B蛋白在BHK-21細(xì)胞中表達(dá)后，破壞了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，并引起了細(xì)胞內(nèi)Ca+濃度的顯著升高