VZV糖蛋白E基因胞外域的克隆、表達(dá)及其應(yīng)用的研究.pdf

1、目的：分別用原核和真核細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)水痘-帶狀皰疹病毒（Varicella-zoster virus,VZV）糖蛋白E（glycoprotein E,gE）的基因胞外域，對(duì)融合蛋白進(jìn)行特異性鑒定和免疫反應(yīng)性分析，將這兩種融合蛋白分別免疫新西蘭家兔，制備兔抗VZV gE多克隆抗體；應(yīng)用融合蛋白作為抗原建立檢測(cè)VZV特異性抗體的血清學(xué)試驗(yàn)，開展對(duì)VZV感染的流行病學(xué)調(diào)查，以評(píng)價(jià)VZV疫苗的免疫效果，為易感人群VZV感染的診斷和治療以及水痘預(yù)防

2、措施的制定提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為研制安全性更高的VZV gE亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　方法：從臨床采集帶狀皰疹患者的皮膚囊泡液接種至單層人胚胎成纖維細(xì)胞(human embryo fibroblast,HF)，進(jìn)行病毒分離；對(duì)分離的病毒株進(jìn)行特征性細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathic effect，CPE），間接免疫熒光和DNA測(cè)序鑒定。將確認(rèn)的VZV臨床分離株體外培養(yǎng)，PCR擴(kuò)增VZV gE基因胞外域片段，分別構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒g

3、E-pET-32a(+)和真核表達(dá)質(zhì)粒gE-pCDNA3.1/myc-His(-)，測(cè)序后將原核質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，以異丙基硫代β-D-半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導(dǎo)，獲得VZV gE原核表達(dá)的融合蛋白。通過SDS-PAGE電泳、Western blot鑒定融合蛋白的特異性，利用Ni2+-NTA柱對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化及柱上復(fù)性。將真核質(zhì)粒用

4、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞，經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)VZV gE蛋白的細(xì)胞株，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-NTA柱純化；通過RT-PCR檢測(cè)VZV gE基因的mRNA，Western blot和間接免疫熒光檢測(cè)gE融合蛋白的免疫反應(yīng)性。
　　分別用純化后的原核表達(dá) gE蛋白和真核表達(dá) gE蛋白免疫新西蘭家兔，獲得兔抗VZV gE多克隆抗體。ELISA法分別測(cè)定該抗體及其效價(jià)。應(yīng)用真核細(xì)胞表達(dá)的gE重組抗原包被ELISA酶標(biāo)板，建立VZ

5、V抗體檢測(cè)的血清學(xué)試驗(yàn)。對(duì)127份0~10歲正常兒童血清中VZV IgG抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)價(jià)VZV疫苗的免疫效果。
　　結(jié)果：利用原核表達(dá)，成功誘導(dǎo)表達(dá)出VZV gE融合蛋白，SDS-PAGE鑒定表明其為包涵體表達(dá)，表達(dá)量約為3.01mg/ml，Ni2+-NTA柱純化后，gE蛋白純度約為90％。Western blot顯示，經(jīng)變性、復(fù)性后的該融合蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。免疫新西蘭家兔后獲得兔抗VZV gE多克隆抗體，ELIS

6、A測(cè)定顯示，多克隆抗體效價(jià)為1:6400~1:12800；利用真核表達(dá)，成功篩選出能夠穩(wěn)定表達(dá)VZV gE基因胞外域的COS-7細(xì)胞株，RT-PCR檢測(cè)到相應(yīng)的mRNA，間接免疫熒光和Western blot鑒定，該gE融合蛋白具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性；COS-7細(xì)胞株和其培養(yǎng)液中均有g(shù)E融合蛋白，表達(dá)量約為0.632mg/ml，Ni2+-NTA柱純化后，gE蛋白純度約為90%。免疫新西蘭家兔后獲得兔抗VZV gE多克隆抗體，ELISA測(cè)定

7、顯示，多克隆抗體效價(jià)為1:25600~1:51200。應(yīng)用真核gE抗原包被ELISA板，檢測(cè)了127份0～10歲兒童血清中VZV IgG抗體，總陽性率為81.89%，特異度和靈敏度分別為93.75%和88.24%。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了穩(wěn)定高效表達(dá)VZV gE蛋白的原核表達(dá)和真核表達(dá)系統(tǒng)，獲得較高純度的gE蛋白，有利于全面研究此蛋白的生物學(xué)功能，并為VZV亞單位疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。制備了特異性及效價(jià)較高的兔抗VZV gE多克