藍(lán)舌病琵12型NS1蛋白單克隆抗體制備及其抗原表位鑒定.pdf

1、藍(lán)舌病(Bluetongue disease，BT)是由藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的一種蟲媒傳染病，可以引起綿羊等反芻動(dòng)物的出血性疾病，主要通過庫蠓等昆蟲叮咬傳播，偶爾通過精液和胎盤傳播。BTV基因組的多樣性和節(jié)段性增加了病毒復(fù)制和組裝過程中基因重組的可能性，目前己發(fā)現(xiàn)27個(gè)不同的血清型，并且同一血清型內(nèi)含有大量的變異毒株。此外，全氣候變暖引起庫蠓等分布范圍的變化，導(dǎo)致世界范圍內(nèi)爆發(fā)BT的可能性增加。與環(huán)

2、狀病毒屬其他成員一致，疫苗免疫是預(yù)防BT和BTV傳播最有效的途徑，但是BTV血清型之間具有很大的抗原差異性，彼此之間缺乏有效的免疫保護(hù)性。因此，制備具有型特異和群特異的單克隆抗體(monoclonalantibody，MAbs)為開發(fā)更好的診斷和研究試劑奠定基礎(chǔ)，在BT防控方面具有重要意義。
　　BTV基因組由10個(gè)分節(jié)段的雙鏈RNA組成(Seg-1～Seg-10)，其中S5基因編碼的NS1蛋白在BTV各血清型之間高度保守。本研究

3、利用實(shí)驗(yàn)室保存的攜帶BTV12 S5基因的重組質(zhì)粒pEASY-NS1-BTV12為模板（GenBank登錄號(hào):KM485310）設(shè)計(jì)上下游引物，PCR擴(kuò)增獲得S5基因編碼區(qū)，獲得的目的基因進(jìn)行酶切后分別克隆轉(zhuǎn)化至原核表達(dá)載體pET-30a和桿狀病毒表達(dá)載體pFastBacTMHTA，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-NS1-BTV12和pFAST-NS1-BTV12。
　　將重組質(zhì)粒pET-NS1-B TV12轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE

4、3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中，利用0.5mM IPTG成功誘導(dǎo)表達(dá)重組BTV12 NS1蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示原核重組NS1蛋白(rP-NS1-BTV12)以包涵體形式表達(dá)。使用Ni2+NTA樹脂對(duì)其進(jìn)行純化，Western blot(WB)驗(yàn)證重組NS1蛋白能與本實(shí)驗(yàn)室保存的BT陽性羊血清發(fā)生反應(yīng)。將重組質(zhì)粒pFAST-NS1-BTV12轉(zhuǎn)化至E.coliDH10B acTM感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組桿粒(rBacmid DNA)。將rBa

5、cmid DNA轉(zhuǎn)染至sf21昆蟲細(xì)胞，得到高效表達(dá)S5基因的重組桿狀病毒BACV-NS1。SDS-PAGE結(jié)果顯示sf21昆蟲細(xì)胞成功表達(dá)重組NS1蛋白(rE-NS1-BTV12)，同樣以包涵體形式存在。電洗脫法洗脫純化重組NS1蛋白，所獲得蛋白同樣可以與BT陽性羊血清發(fā)生反應(yīng)。
　　利用免疫BALB/c小鼠的脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合技術(shù)獲得雜交瘤細(xì)胞，并通過間接ELISA篩選出25株穩(wěn)定分泌抗NS1蛋白的雜交瘤細(xì)胞株。

6、WB結(jié)果顯示，25株MAbs與rP-NS1-BTV12和rE-NS1-BTV12均呈陽性反應(yīng)，而與只表達(dá)空載體pET-30a和野生型桿狀病毒的蛋白呈陰性反應(yīng)。IFA顯示25株MAbs中22株雜交瘤細(xì)胞與BTV12呈陽性反應(yīng)，而3株雜交瘤細(xì)胞((2B7、3E9和4B9)）與BTV12呈陰性反應(yīng)。22株陽性雜交瘤細(xì)胞中6株雜交瘤細(xì)胞(1F11、2F2、2C11、3C2、3G6和4E5)與感染BTV1-24型均呈陽性反應(yīng);而1F8雜交瘤細(xì)胞株

7、僅與BTV12反應(yīng)。剩余的15株雜交瘤細(xì)胞與BTV血清型的反應(yīng)圖譜各有差異。
　　為鑒定25株MAbs所識(shí)別的抗原表位，我們?cè)O(shè)計(jì)了55對(duì)覆蓋整個(gè)NS1蛋白的引物，通過原核表達(dá)方法表達(dá)出55條MBP融合短肽，以此作為包被抗原通過間接ELISA方法共篩選7個(gè)線性B細(xì)胞表位，另有4株MAbs(1B2、2E8、3E9和3D10)不與任何短肽反應(yīng)，推測可能為構(gòu)象表位。隨后，對(duì)獲得的B細(xì)胞線性表位在呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬成員之間進(jìn)行氨基酸序列