葡萄球菌B型腸毒素中毒救治的藥物研究.pdf

1、背景:金黃色葡萄球菌B型腸毒素(SEB)作為金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一種重要的外毒素,中毒劑量低,人的致吐劑量僅為0.4μg/kg,是胃腸道強(qiáng)有力的致病毒素。對 SEB攝取的劑量以及途徑的不同,會導(dǎo)致不同的中毒效果,包括普通的食物中毒、急性和致死性呼吸衰竭以及毒素中毒性休克綜合癥等。近年來腸毒素污染造成的突發(fā)公共事件也一直困擾著人們,對人類健康、社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的威脅越來越大,造成的損失也越來越大。該毒素通過呼吸道、消化道等多種途徑侵入人體致病

2、。例如1999年的全國城運(yùn)會上,51名運(yùn)動員發(fā)生葡萄球菌腸毒素食物中毒,迫使部分比賽取消,2003年日本發(fā)生的葡萄球菌腸毒素污染牛奶事件,導(dǎo)致14889人中毒。此外SEB是美國已經(jīng)公布裝備的標(biāo)準(zhǔn)生物戰(zhàn)劑之一,也是生物武器核查單上的失能性戰(zhàn)劑。其沒有傳染性,主要以氣溶膠的形式傳播,而且制備簡單、產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好很容易成為生物戰(zhàn)和恐怖分子應(yīng)用的工具。
　　目的:針對SEB中毒救治,目前國內(nèi)外主要從兩個方面進(jìn)行救治藥物研究:一是篩選 S

3、EB拮抗肽類藥物,二是從已上市或即將上市的小分子抗炎癥化學(xué)藥物中篩選有效的SEB中毒治療性藥物。這兩類藥物均可以減少細(xì)胞因子釋放、減輕休克癥狀,治療SEB的中毒效應(yīng)。本文擬通過建立體內(nèi)外篩選模型,以期篩選到療效更好、毒性更低的SEB蛋白類和化學(xué)類救治藥物。
　　內(nèi)容:實(shí)驗(yàn)第一部分首先建立小鼠致死性休克模型,選擇受試小分子化學(xué)藥物甲潑尼龍?jiān)谛∈笾滤佬孕菘梭w內(nèi)模型中進(jìn)行保護(hù)性實(shí)驗(yàn),并進(jìn)行體內(nèi)外藥效學(xué)評價(jià)。實(shí)驗(yàn)第二部分對獲贈SEB受體類

4、拮抗劑質(zhì)粒,選取大腸桿菌進(jìn)行目的蛋白表達(dá)純化,通過ELISA分析該受體拮抗劑與SEB的親合力,此外還對該質(zhì)粒進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造,去除組氨酸標(biāo)簽并在大腸桿菌中表達(dá)。第三部分構(gòu)建SEB受體拮抗劑的重組質(zhì)粒,選擇畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對目的蛋白進(jìn)行表達(dá)。
　　方法:實(shí)驗(yàn)第一部分建立脂多糖(LPS)增強(qiáng)SEB引起的小鼠中毒性休克模型,給BALb/c雄性小鼠腹腔注射SEB1μg/只4h后,注射 LPS175μg/只,并設(shè)置PBS空白組和LPS、SEB

5、對照組,觀察所有小鼠注射SEB后96小時的存活情況,每隔12小時觀察一次。選取甲潑尼龍多個劑量(75mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、12.5mg/kg)和不同給藥時間(3.75h、4.25h、4.5h、5h)在該小鼠中毒休克模型中進(jìn)行劑量-效應(yīng)關(guān)系研究。在小鼠給予 SEB8h后取血,分離血清,通過ELISA方法檢測藥物抑制TNF-α, IL-1α及IFN-γ細(xì)胞因子的分泌。用Grahpad軟件統(tǒng)計(jì)各組間各細(xì)胞因子含量及小鼠生

6、存時間差異。同時進(jìn)行體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn):
　　1、抑制細(xì)胞因子分泌實(shí)驗(yàn):從健康人外周血中分離PBMC,加受試物共培養(yǎng)16h,ELISA檢測培養(yǎng)上清中TNF-α, IL-1β及IFN-γ等炎癥因子的含量。結(jié)果用Graphpad統(tǒng)計(jì)組間差異
　　2、抑制人T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):從健康人外周血中分離PBMC,加或不加受試物與SEB共培養(yǎng)72h后,用Luminescent Cell Viability Assay檢測細(xì)胞增殖情況,結(jié)果用G

7、raphpad統(tǒng)計(jì)組間差異。
　　實(shí)驗(yàn)第二部分將獲贈質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL-21(DE3)中對目的蛋白進(jìn)行表達(dá),將表達(dá)產(chǎn)物溶解在8M尿素中進(jìn)行變性,然后表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過Ni柱親和層析純化,并在純化完成后進(jìn)行梯度復(fù)性,利用ELISA分析目的蛋白與SEB的結(jié)合能力,并利用純化的包涵體蛋白制備了SEB受體蛋白的多克隆抗體,此外還對該質(zhì)粒進(jìn)行了去除組氨酸標(biāo)簽的改構(gòu)。
　　實(shí)驗(yàn)第三部分設(shè)計(jì)引物,將目的基因片斷進(jìn)行PCR,與pPIC9k連接,

8、并電轉(zhuǎn)至畢赤酵母 KM71的感受態(tài)中,挑選陽性轉(zhuǎn)化子,進(jìn)行發(fā)酵表達(dá),并對目的蛋白進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)第一部分在LPS增強(qiáng)SEB引起的小鼠中毒性休克模型中,聯(lián)合給藥組小鼠在12至48小時內(nèi)出現(xiàn)中毒休克癥狀并在48小時后全部死亡。在甲潑尼龍救治小鼠SEB中毒休克的實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)腹腔注射SEB后,注射75mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、12 mg/kg甲潑尼龍,其對小鼠的保護(hù)率分別為100％、80

9、％、60％、40％與對照組比較存在顯著性差異。腹腔注射SEB后,3.75h、4.25h、4.5h、5h分別注射25mg/kg甲潑尼龍,小鼠的存活率為90％、70％、60％、30％與對照組相比,3.75h、4.25h給藥組有顯著性差異。相比LPS和SEB聯(lián)合注射對照組,甲潑尼龍救治組的中毒小鼠8h血清中的TNF-α、IFN-γ、IL-1α分別被抑制了60％、93％、95％相比對照組有顯著性差異。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度的甲潑尼龍與SEB共培養(yǎng)

10、后,40μg/ml、4μg/ml、0.4μg/ml劑量組的PBMC培養(yǎng)上清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β的釋放水平相比SEB對照組,存在顯著性差異。同時,甲潑尼龍能夠抑制SEB引起的T淋巴細(xì)胞增殖,400μg/ml、40μg/ml、4μg/ml劑量組與SEB對照組都有顯著性差異。
　　實(shí)驗(yàn)第二部分中,SEB受體拮抗劑成功表達(dá),通過ELISA檢測該蛋白與SEB之間結(jié)合能力均可以達(dá)到ng/ml,去除組氨酸標(biāo)簽的SEB受體拮抗劑改

11、構(gòu)成功,并在大腸桿菌中表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)第三部分中,SEB受體拮抗劑的目的片斷與pPIC9K表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,蛋白在畢赤酵母 KM71中成功表達(dá),經(jīng) Western免疫印跡驗(yàn)證該蛋白為SEB受體拮抗劑。
　　結(jié)論:1、本實(shí)驗(yàn)篩選到甲潑尼龍?jiān)谛∈笾滤佬孕菘梭w內(nèi)模型中可對SEB致死起到顯著保護(hù)作用,可顯著降低SEB對TNF-α、IFN-γ、IL-1α炎癥因子的誘導(dǎo)作用,體外可顯著抑制人PBMC增殖和人TNF-α、IFN