大鼠單克隆抗體平臺(tái)的初步建立及應(yīng)用.pdf

1、大鼠-大鼠雜交瘤是繼小鼠雜交癌之后發(fā)展起來的另外一種單克隆抗體制備技術(shù)，其與小鼠雜交瘤技術(shù)相比，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如抗原識(shí)別譜廣、抗體產(chǎn)量高、可用于小鼠抗原的研究等，故其作為小鼠雜交瘤技術(shù)的良好補(bǔ)充，具有極大的科研價(jià)值和良好的應(yīng)用前景。
　　 在小鼠單克隆抗體制備過程中，對(duì)于小鼠免疫效果的評(píng)價(jià)，目前采用的方式均為檢測(cè)免疫小鼠的抗血清滴度，其結(jié)果僅能夠反映小鼠常規(guī)免疫階段的體液免疫應(yīng)答，而不能夠反映小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答及最后一次加強(qiáng)免疫

2、（尾靜脈注射、脾免）的效果，但最后一次加強(qiáng)免疫對(duì)雜交瘤制備時(shí)的融合陽性率及后期所得單抗親和力性質(zhì)等方面均有著至關(guān)重要的影響，因此，有必要對(duì)此種免疫評(píng)價(jià)方式加以完善。IFN-γ是主要由激活的T淋巴細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，研究表明，內(nèi)源性IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)，所以通過對(duì)小鼠脾細(xì)胞經(jīng)免疫原刺激后分泌IFN-γ水平的定量檢測(cè)，可以更加準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)小鼠的免疫效果。
　　 本研究從國外引進(jìn)Lou/C大鼠鼠

3、種，并對(duì)大鼠免疫、細(xì)胞融合、細(xì)胞株克隆化、腹水生產(chǎn)及純化等一系列實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行摸索，成功建立基于大鼠-大鼠雜交瘤技術(shù)的大鼠單克隆抗體制備平臺(tái)，并利用該平臺(tái)制備了大鼠抗小鼠IFN-γ單克隆抗體，進(jìn)而建立起定量檢測(cè)小鼠IFN-γ的雙抗夾心ELISA方法，用于小鼠細(xì)胞免疫效果的評(píng)價(jià)。
　　 首先，利用重組蛋白作為抗原，以不同的免疫方式（皮下注射、腹腔注射）對(duì)Lou/C大鼠進(jìn)行常規(guī)免疫，通過抗血清滴度跟蹤檢測(cè)初步評(píng)價(jià)免疫效果進(jìn)而確定免疫方

4、式；對(duì)大鼠淋巴瘤細(xì)胞系YB2/0進(jìn)行Lou/C腹水誘導(dǎo)驗(yàn)證，確定其可用于大鼠雜交瘤細(xì)胞制備，同時(shí)財(cái)其與大鼠脾細(xì)胞的融合條件進(jìn)行一系列摸索，初步確定了最佳融合方案，保證細(xì)胞融合率；采用有限稀釋計(jì)數(shù)法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)克隆化得到穩(wěn)定雜交瘤細(xì)胞株，并嘗試進(jìn)行Lou/C大鼠腹水誘導(dǎo)；摸索并確定從大鼠腹水中純化單抗的方法，對(duì)所得單抗進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，最終成功建立起完整的大鼠單克隆抗體制備平臺(tái)。
　　 其次，采用RT-PCR方法從小鼠脾臟細(xì)胞

5、中擴(kuò)增出小鼠IFN-γ全長(zhǎng)cDNA序列，以該產(chǎn)物為模板，進(jìn)一步PCR得到編碼小鼠IFN-γ成熟蛋白的DNA片段，將其亞克隆至原核表達(dá)載體pET-22b+上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并利用離子交換層析純化得到純度＞90％的目的蛋白。用商品化的mIFN-γELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)目的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示目的蛋白與單抗具有良好的反應(yīng)性，可作為免疫原用于大鼠免疫及抗體制備。
　　 最后，利用重組表達(dá)mIFN-γ免疫Lou/

6、C大鼠，制備得到5株大鼠單抗，并進(jìn)行HRP標(biāo)記；利用方正滴定法篩選出可用于mIFN-γ檢測(cè)的最佳單抗配對(duì)8H7/14C9-HRP，建立mIFN-γ雙抗夾心ELISA定量檢測(cè)方法；用該方法對(duì)mIFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示其線性范圍為6400～200pg/ml(R2=0.986)，檢測(cè)靈敏度為200pg/ml;與同類商品化試劑盒同時(shí)檢測(cè)mIFN-γ重組蛋白，結(jié)果顯示二者靈敏度相當(dāng)，檢測(cè)結(jié)果無顯著差異。
　　 總之