磺胺二甲嘧啶單克隆抗體的制備以及ELISA方法的初步建立.pdf

1、磺胺類藥物(Sas)是一類廣譜抗菌藥，臨床上主要用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病，還常作為飼料添加劑在動(dòng)物生產(chǎn)中長期使用，但其在動(dòng)物性食品中的殘留及其對(duì)人類健康所造成的危害日益為人們重視。因此，建立一套靈敏、快速的檢測(cè)方法就尤為重要。常規(guī)理化分析方法雖然具有靈敏度高、可定性、定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但是在實(shí)際樣品應(yīng)用中，樣品前處理過程復(fù)雜，分析速度慢，加之需要昂貴、精密的實(shí)驗(yàn)儀器和專業(yè)技術(shù)人員操作，使得分析成本高，難以滿足高通量和現(xiàn)場快速檢測(cè)的要求

2、。以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫分析方法為獸藥殘留的檢測(cè)開辟了一條新途徑，它具有預(yù)處理簡單、靈敏度高、快捷、高通量、可定性定量檢測(cè)等諸多優(yōu)點(diǎn)，自上世紀(jì)80年代末開始應(yīng)用于獸藥殘留的檢測(cè)，目前已建立了針對(duì)多種獸藥殘留的分析方法，并有相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒問世。該法的推廣應(yīng)用從根本上解決了戶外獸藥殘留快速、實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確分析的問題，對(duì)環(huán)境污染的監(jiān)控、維護(hù)人類健康、擴(kuò)大農(nóng)畜產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易等都具有深遠(yuǎn)的意義。 本研究采用戊二醛法將磺胺二甲嘧啶與

3、載體蛋白交聯(lián)，鑒定后將其免疫Balb/c小鼠，隨后以常規(guī)細(xì)胞融合方法制備了特異的抗磺胺二甲嘧啶抗體；建立了磺胺二甲嘧啶競爭性酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，確定了校正曲線的動(dòng)力學(xué)范圍；對(duì)磺胺二甲嘧啶的ELISA分析方法進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)；對(duì)緩沖液中離子強(qiáng)度、pH值、有機(jī)溶劑含量對(duì)icELISA法的影響進(jìn)行了分析；向牛奶、蜂蜜和豬尿樣本添加磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品，分別計(jì)算它們

4、的平均回收率來判定ELISA檢測(cè)方法的可行性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：(1)成功交聯(lián)了磺胺二甲嘧啶與載體蛋白；常規(guī)方法免疫小鼠并制備雜交瘤細(xì)胞株，獲得了兩株抗磺胺二甲嘧啶的單克隆抗體，且具有效價(jià)高，特異性好等特點(diǎn)；(2)探討了幾種理化因素對(duì)競爭性ELISA的影響：pH為7.4時(shí)OD值最高，pH在5.0-8.5范圍內(nèi)對(duì)OD值和IC50影響較小。離子強(qiáng)度過高會(huì)導(dǎo)致IC50的增加，離子強(qiáng)度低對(duì)IC50和OD值影響較小。當(dāng)甲醇含量低于30％時(shí)，

5、反應(yīng)幾乎不受影響，IC50和Odmax無明顯變化，當(dāng)甲醇含量達(dá)到50％時(shí)，Odmax顯著降低，IC50則無法測(cè)出。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們選擇0.02M、pH 7.4磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline，PBS)作為ELISA的緩沖體系；(3)建立了磺胺二甲嘧啶的競爭性ELISA，其IC50為0.344ng/ml，靈敏度為0.1ng/ml，動(dòng)力學(xué)校正曲線范圍為0.1-8.1 ng/ml；(4)對(duì)牛奶、蜂蜜、豬尿進(jìn)行