黃曲霉毒素B1生物降解產(chǎn)物的分離鑒定及其致突變性研究.pdf

1、黃曲霉毒素是農(nóng)牧業(yè)和食品工業(yè)的重大威脅，每年全世界有四分之一以上的谷物受真菌毒素污染，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，引起國(guó)際社會(huì)廣泛關(guān)注。本文主要對(duì)施氏假單胞菌F4降解黃曲霉毒素B1(AFB1)的特點(diǎn)，降解產(chǎn)物的分離鑒定，以及降解產(chǎn)物的致突變性等進(jìn)行了研究，主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.采用蛋白酶K和SDS處理法對(duì)AFB1的酶解作用進(jìn)行了研究。以F4懸浮液進(jìn)行AFB1（5μg/mL）的降解，共培養(yǎng)72 h后降解率達(dá)86.6％，至10

2、2 h檢測(cè)不到AFB1殘留。SDS處理的細(xì)胞懸浮液降解能力顯著下降，僅為未處理組的10％。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)取到的降解液上清繼續(xù)保溫48 h后，檢測(cè)殘留毒素降解情況，發(fā)現(xiàn)60 h的降解液上清對(duì)殘留AFB1降解效果最好，相對(duì)60 h的初始毒素殘留，降解率達(dá)84.26％。利用蛋白酶K和SDS分別對(duì)60 h的降解液上清進(jìn)行處理后，繼續(xù)作用48 h，降解率分別下降至45.42％和13.62％。表明蛋白酶K和SDS對(duì)F4產(chǎn)生的活性蛋白有抑制或破壞作用，

3、使降解活性有較大下降。利用經(jīng)過1μg/mL AFB1誘導(dǎo)的F4對(duì)毒素進(jìn)行降解時(shí)，降解率未見明顯提高。結(jié)果表明，F(xiàn)4產(chǎn)生的能夠降解AFB1的活性物質(zhì)為生物酶，且該酶為非誘導(dǎo)性胞內(nèi)酶。
　　 2.AFB1降解產(chǎn)物的分離及結(jié)構(gòu)分析。紫外-可見全波長(zhǎng)掃描確定了產(chǎn)物可能的最大吸收波長(zhǎng)位于200 nm～210 nm和250 nm～260 nm之間;HPLC紫外波長(zhǎng)梯度每隔5nm檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在205 nm出現(xiàn)兩個(gè)新吸收峰，初步定為產(chǎn)物1和產(chǎn)物2。

4、將各時(shí)間點(diǎn)取到的樣品分別進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩種產(chǎn)物與AFB1存在著明顯的轉(zhuǎn)化關(guān)系。TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物1可能有著微弱的黃色熒光吸收。一級(jí)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(Q-TOF)檢測(cè)表明產(chǎn)物2的分子量為206.0564，Mass Professional Profile(MPP)軟件分析產(chǎn)物2分子式為C11H10O6。二級(jí)Q-TOF檢測(cè)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物2與AFB1有多個(gè)離子碎片相似，這表明產(chǎn)物2與AFB1母體有著很高的同源性，進(jìn)一步確定了其為AFB1的降解產(chǎn)物

5、。對(duì)產(chǎn)物2的極性、降解前后降解液的pH變化及產(chǎn)物2的二級(jí)質(zhì)譜碎片結(jié)構(gòu)進(jìn)行逐步分析，得到產(chǎn)物2可能的結(jié)構(gòu)式，為6-甲氧基-[4,91苯并-2，10，11，13-四氫-[11，13-環(huán)氧乙烷]雙呋喃，從而明確了AFB1轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物2的降解途徑，為了解F4對(duì)AFB1的整個(gè)降解途徑提供了依據(jù)。
　　 3.采用Ames試驗(yàn)對(duì)AFB1降解后產(chǎn)物的致突變性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。利用平板參入法，用一組經(jīng)生物學(xué)特性試驗(yàn)鑒定合格的Ames試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株（組氨酸缺

6、陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102），分別對(duì)0h降解液上清、0h對(duì)照（無AFB1）、102 h降解液上清（含產(chǎn)物）和102 h對(duì)照（無產(chǎn)物）進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論在經(jīng)S9代謝活化(S9+)或未經(jīng)S9代謝活化（S9-）條件下，102 h降解液上清對(duì)四株菌的回變菌落數(shù)與102 h對(duì)照組一致，且在四組濃度梯度之間沒有劑量-回變關(guān)系，各菌落回變數(shù)也明顯低于陽性對(duì)照;102h對(duì)照組與溶劑對(duì)照相比雖有部分菌落回變數(shù)增長(zhǎng)，

7、但無有劑量-回變關(guān)系，可能是F4產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物有微量的致突變作用。0h降解液上清對(duì)TA97（S9-）、TA98（S9-）和TA102(S9+)的菌落回變數(shù)極大，且呈明顯劑量回變關(guān)系，這也說明了AFB1的強(qiáng)致突變性;而0h對(duì)照組在S9-和S9+兩種情況下菌落回變數(shù)均與溶劑對(duì)照一致。因此，AFB1經(jīng)F4生物降解后，致突變性顯著降低，降解產(chǎn)物的致突變性可被定為致突變陰性，即低毒或無毒。這說明施氏假單胞菌F4將AFB1降解為低毒或者無毒的產(chǎn)物。