體內(nèi)外感染BALB-c小鼠HCMV分離株UL83、UL54基因遺傳變異的研究.pdf

1、目的:將體內(nèi)外感染BALBIc小鼠人巨細(xì)胞病毒(bLllmancytomegalovirus，HCMV)分離株UL83、U154基因進(jìn)行遺傳變異分析，篩選影響病毒跨種屬感染的相關(guān)基因，為進(jìn)一步探索其機制提供線索。 方法:(1)1.45x106 PFtJ/ml的HCMV ADl69株(本室保存)、3×105PFIJh'nl的山東株(山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈)腹腔注射6～8周SPF級BAL,B/c小鼠1.0ml/只，雌雄各6只作為實驗組

2、，同時設(shè)立滅活病毒對照組和細(xì)胞對照組。一個月后取各組小鼠大腦皮質(zhì)組織接種人胚胎成纖維細(xì)胞(HF)進(jìn)行病毒分離與鑒定(PCR，檢測HCMVUI,83)、RT-PCR檢測大腦組織勻漿中HCMV UL54基因的轉(zhuǎn)錄。將從小鼠體內(nèi)分離到的HCMV病毒命名為體內(nèi)株(下同)。(2)以MOI=100的HCMVADl69株接種至BALB/C小鼠原代胚胎成纖維細(xì)胞(MF)和HF細(xì)胞，鏡下逐日觀察HCMV特征性細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)并傳代三次。待出現(xiàn)細(xì)胞病

3、變后采用PCR和RT-PCR檢測HCMV特異性基因IJL83、IE基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。將從MF中分離到的HCMV病毒命名為體外株(下同>。山東株、臨床分離株接種至HF細(xì)胞后進(jìn)行傳代，分別命名為山東株和臨床分離株(下同)。(3)對各分離株提取DNA進(jìn)行UL83、UL54基因全長的PCR擴增并測序，將得到的序列與其他皰疹類病毒的代表毒株以及MCMV進(jìn)行比對，經(jīng)MEGA 4.0軟件分析繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。 結(jié)果:(1)1.45x106 P

4、FU/ml的HCMV ADl69株注射BALB/e小鼠，一月后取大腦皮質(zhì)組織勻漿直接接種HF，實驗組雌性小鼠病毒接種管出現(xiàn)細(xì)胞腫脹變圓，胞內(nèi)顆粒增多，折光性增強。將培養(yǎng)物連續(xù)傳代三次，仍然可觀察到明顯CPE。 6細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)PCR檢測HCMV UL83基因為陽性。大腦組織勻漿直接進(jìn)行HCMv UL54基因的RT-PCR檢測，結(jié)果為陽性。3×105PFU/ml的山東株、滅活病毒組、HF對照組、實驗組雄性小鼠，上述各項檢測均為陰性。(2)M

5、OI=100HCMV AD169株分別接種至MF細(xì)胞和HF細(xì)胞后，可觀察到MF細(xì)胞出現(xiàn)病毒所致CPE，與HF細(xì)胞上的CPE相似，細(xì)胞培養(yǎng)物均經(jīng)PCR、RT-PCR檢測HCMV UL83、IE基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，結(jié)果為陽性。(3)四株病毒的UL83、Ul54基因序列經(jīng)Clustal w軟件比對分析后發(fā)現(xiàn)：UL83基因及其編碼氨基酸序列與Genebank公布的HCMV標(biāo)準(zhǔn)株相應(yīng)序列的同源性在98％～100％之間，UL54基因及其編碼氨基酸序列

6、的同源性在99％～100％之間。在發(fā)生突變的核苷酸和氨基酸位點中，體內(nèi)株Ul83基因的第682～684位點由CTG突變?yōu)門CT，導(dǎo)致第228位氨基酸發(fā)生了亮氨酸到絲氨酸的突變。經(jīng)MEGA4.0軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹后發(fā)現(xiàn)：能夠適應(yīng)小鼠體內(nèi)環(huán)境，并感染小鼠大腦皮質(zhì)的HCMV，其Ul83基因在進(jìn)化樹上處在另一獨立的支群內(nèi)，其余各株的UL83基因與標(biāo)準(zhǔn)株、Merlin、Towne處于同一支群。四株病毒的UL54基因處在同一支群。 結(jié)論:

7、從體內(nèi)外感染HCMV的BALB/c小鼠大腦組織與原代MF中分離得到了能在小鼠大腦組織與細(xì)胞中增殖復(fù)制的HCMV毒株。通過對各個毒株UL83、UL54基因全長的PCR擴增并測序，比對分析后發(fā)現(xiàn)：體內(nèi)株UL83基因編碼的氨基酸序列在228位發(fā)生了突變，而此位點具有誘發(fā)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxie T lymphocyte CTL)反應(yīng)的潛力。經(jīng)進(jìn)化關(guān)系分析后發(fā)現(xiàn)能夠適應(yīng)小鼠體內(nèi)環(huán)境，并感染小鼠大腦皮質(zhì)的HCMV ADl69株，其UL8