鴨瘟病毒中國強毒株基因組解析及UL55基因功能初步研究.pdf

1、鴨瘟(duck plague)又稱鴨病毒性腸炎(duck virus enteritis)，是鴨、鵝和其他雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。本病發(fā)病快、死亡率高，是目前世界各國水禽業(yè)危害最嚴重的傳染病之一。該病的病原鴨瘟病毒(DuckPlague virus，DPV)是皰疹病毒科（Herpesvirales）、α皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae）、馬立克氏病毒屬（Mardivirus）的成員之一。但由于DPV的

2、研究起步晚，其分子生物學研究遠遠落后于其它皰疹病毒。一段時間以來對于DPV的研究多集中于流行病學、診斷和防治等方面;與其分子生物學特性相關的基礎研究，如病毒的基因組結構、物理圖譜、病毒基因功能以及病毒在機體細胞和組織中的復制及致病機理、病毒感染過程以及機體抗病毒感染機制等多方面研究均有許多不明之處。因此本論文的主要目的就是希望對本實驗室測序獲得的鴨瘟病毒基因組序列進行解析;并通過構建一個可以對DPV進行細菌遺傳學操作的平臺，為DPV的基

3、因功能研究提供技術手段的支持，此外利用該平臺用兩步RED重組敲除UL55基因，驗證此平臺的可行性并初步闡釋UL55功能。主要研究內(nèi)容如下:
　　1、鴨瘟病毒中國強毒株基因組信息解析
　　對本實驗室測序獲得的鴨瘟中國強毒株的基因組序列進行生物信息學分析。鴨瘟病毒中國強毒株基因組組成為雙股線狀雙鏈DNA: UL-IRS-US-TRS，是典型的D型皰疹病毒基因組結構。DPV CHv基因組全長162，175 bp，GC含量為44.8

4、9％，包括潛在的76個能編碼功能蛋白的ORF。BLAST搜尋相似性序列發(fā)現(xiàn)五條與DPV CHv同期或之后提交的其他鴨瘟病毒毒株全基因組序列，他們間具有高度同源性，進化樹分析顯示六株DPV病毒按地域和毒力差異進行分類，DPV CHv處于進化樹的中間位置。對基因組編碼區(qū)的ORF進行掃描分析發(fā)現(xiàn)，六株DPV在UL、US區(qū)域分別有23、5個ORF在核苷酸水平上存在整個ORF的缺失、部分序列插入、缺失等情況出現(xiàn)，這些突變的產(chǎn)生可能是造成六株不同來

5、源毒株毒力和地理差異的主要原因。而DPV基因組中不存在核苷酸序列插入或缺失的53個ORF在氨基酸水平上高度同源，多為DPV基因組的保守性基因，不受病毒傳代致弱及地域差異的影響，編碼蛋白大多為與病毒DNA代謝相關的結構蛋白。密碼子使用模式分析結果顯示其在基因組密碼子的使用上偏向A/T結尾的密碼子，其密碼子使用模式主要受突變壓力的影響。將其與人類、大腸桿菌、酵母的密碼子使用模式進行比較，結果表明鴨瘟病毒的密碼子使用模式與酵母系統(tǒng)更為接近。<

6、br>　　2、鴨瘟病毒UL55基因生物信息學分析
　　DPV UL55基因由561bp核苷酸組成，包括一個完整的開放性閱讀框，編碼一個由186個氨基酸組成的20.7981kDa蛋白質。UL55蛋白沒有信號肽及跨膜區(qū)。密碼子分析顯示UL55基因偏向A/T結尾的密碼子，密碼子使用模式與人類最接近。UL55蛋白整體表現(xiàn)出親水性，抗原表位主要集中在相應親水區(qū)域的無規(guī)則卷曲，其功能與病毒的裝配、出芽、成熟和釋放相關。基于核苷酸序列的進化樹分

7、析顯示DPV屬于馬立克氏病毒基因屬的一員。
　　3、鴨瘟病毒UL55基因的克隆、原核表達及多克隆抗體制備
　　通過將UL55基因通過克隆到表達載體pET32a(+)上實現(xiàn)對UL55蛋白的原核表達，試驗表明重組UL55基因能在大腸桿菌BL21(DE)中進行融合表達。通過優(yōu)化誘導表達條件，UL55重組蛋白能在37℃條件下，通過0.8mM的IPTG誘導表達4h產(chǎn)生大量非可溶形式的包涵體蛋白。將包涵體蛋白通過裂解后進行純化及復性處理

8、再與兔抗DPV CHv多克隆抗體進行免疫印跡反應，結果表明純化復性后的UL55蛋白具有與天然蛋白相似的免疫反應活性。復性后的UL55蛋白免疫兔子制備的高免血清能夠與UL55重組蛋白發(fā)生良好的免疫反應。
　　4、原核表達UL55蛋白作為抗原檢測DPV血清的間接ELISA方法的建立
　　本方法是基于純化的重組UL55原核表達蛋白建立的可以檢測DP血清的間接ELISA法，該方法特異性強，對抗鴨病毒性肝炎病毒(DHV)、鴨疫里默氏菌

9、(RA)、鴨大腸桿菌(E.coli)、鴨源沙門氏菌(Salmonella)、腫頭性出血癥病毒和鴨源流感病毒的陽性血清進行檢測，結果均為陰性;該方法的對酶標板內(nèi)或板間重復試驗顯示變異系數(shù)均小于10％，能檢出經(jīng)1∶6400倍稀釋的DPV弱毒疫苗免疫鴨的陽性血清。將其與經(jīng)典的中和試驗及DPV全病毒包被的ELISA同時檢測50份感染了DPV的臨床鴨血清樣本，發(fā)現(xiàn)其對DPV IgG的檢出率介于中和試驗和DPV-ELISA之間。由于其制備方法簡便、

10、操作簡單，特異性、靈敏性較高。且不存在散毒的風險，具有良好的應用前景，為進一步組裝成試劑盒奠定了基礎。
　　5、鴨瘟病毒UL55基因轉錄、表達時相分析
　　以β-actin基因作為內(nèi)參基因，用相對熒光定量方法對UL55基因在體外感染宿主細胞中的轉錄情況進行了分析。轉錄時相分析結果表明UL55基因在轉錄后的0-8h內(nèi)處于一個較低的水平;12h后開始迅速增加直至在感染后36h達到轉錄峰值，之后開始逐步下降，直到感染后的60h仍然

11、可以檢測到大量轉錄的UL55基因，UL55基因的轉錄過程可以被核酸抑制劑更昔洛韋抑制，說明UL55基因是嚴格依賴于DNA合成的γ2基因。Western-blot分析體外感染宿主細胞中UL55基因的表達時相表明UL55蛋白的表達水平也表現(xiàn)出相似的規(guī)律，進一步佐證了UL55基因為γ2基因的結論。
　　6、細菌人工染色體重組鴨瘟病毒拯救系統(tǒng)平臺構建
　　通過多步克隆構建了含TK基因同源臂、報告基因EGFP和細菌人工染色體核心功能元

12、件的重組鴨瘟病毒轉移載體pUC18/EGFP-TKAB-BAC11，將其與DPV CHv病毒核酸共轉染獲得了重組病毒DPV CHv-BAC-G。利用EGFP報告基因的指示作用，通過8輪噬斑純化獲得了純化的重組病毒。提取環(huán)化時期的重組病毒DPV CHv-BAC-G，電擊轉化至DH10B細胞中，獲得了能夠在細菌中復制的重組病毒轉化子。將克隆化的病毒質粒pBAC-DPV轉染至宿主細胞DEF，成功拯救出重組病毒DPV CHv-BAC-G。拯救出

13、的重組病毒可以以細菌和病毒兩種形式存在，能夠實現(xiàn)在細菌和宿主細胞內(nèi)的同時復制，有利于利用原核系統(tǒng)成熟的基因操作手段研究原本僅能在細胞水平研究的鴨瘟病毒，成功建立細菌人工染色體重組鴨瘟病毒拯救系統(tǒng)平臺。
　　7、重組鴨瘟病毒UL55基因缺失株的構建及其體外生物學特性研究
　　在構建的細菌人工染色體重組鴨瘟病毒拯救系統(tǒng)平臺基礎上，利用大腸桿菌細胞內(nèi)的兩步RED重組技術構建UL55基因缺失株及其回復突變株。構建的回復突變株克隆能夠

14、通過轉染DEF細胞獲得拯救產(chǎn)生與親本相同的致細胞病變，酶切圖譜與親本株DPV CHv-BAC-G無差異，是為真正的回復突變株?？瞻咴囼?、一步生長曲線和致病性比較結果表明，構建的UL55缺失株和回復突變株與預期結果一致，能產(chǎn)生與親本株DPV CHv-BAC-G相似細胞病變效應、形成形態(tài)及大小相似的空斑、在感染細胞中展現(xiàn)出相同的增殖周期。
　　8、DPV UL55基因在感染宿主細胞體內(nèi)的定位分析
　　以制備的兔抗UL55多克隆抗

15、體作為一抗，用間接免疫熒光的方法檢測UL55基因編碼蛋白在感染細胞內(nèi)的動態(tài)分布。結果顯示，UL55蛋白最早在感染后的5.5h內(nèi)開始在細胞質大量表達，并隨著時間的推移表達量逐漸增多，其表達量在感染后的22.5h達到峰值。之后UL55蛋白的表達量逐步下降，并從細胞質內(nèi)的散在分布顆粒逐漸形成熒光斑向核膜周邊轉移，大量存在于核膜兩極。之后隨著時間的推移，UL55蛋白的熒光逐漸消失，推測其隨著病毒復制周期的結束和細胞的崩解而消失。
　　9、