玉米幼胚胚性愈傷組織誘導能力全基因組遺傳解析及候選基因功能研究.pdf

1、玉米是全世界重要的糧食作物和能源作物，中國雖然是全世界玉米第二大生產國，但是缺乏抗逆、抗病、高配合力和適應性廣的優(yōu)質玉米種質資源。轉基因育種是改良玉米種質資源的重要途徑之一。玉米幼胚誘導的胚性愈傷組織是國際上廣泛采用的轉基因玉米受體類型，但由于生產上使用的玉米骨干自交系胚性愈傷組織誘導率普遍很低，而不能直接作為轉基因的受體材料。傳統的轉基因玉米育種流程要經過遺傳轉化、自交純合、回交轉育及雜交組培幾個環(huán)節(jié)，一般從轉基因陽性材料自交純合到回

2、交轉育獲得轉基因骨干自交系至少需要3～6年。玉米胚性愈傷組織誘導率因材料間基因型不同而差異較大，克隆控制胚性愈傷組織誘導率主效基因，解析玉米胚性愈傷組織誘導機理，創(chuàng)制更多的高胚性愈傷組織誘導率玉米自交系有利于整個玉米轉基因育種領域的快速發(fā)展。
　　本研究選取301份遺傳豐富、胚性愈傷組織誘導能力具有代表性的自交系組成的自然群體和高胚性愈傷組織誘導率自交系18-599R作為供試材料，結合全基因組關聯分析與Solexa數字基因表達譜等

3、手段鑒定控制胚性愈傷組織誘導能力、調控胚性愈傷組織誘導過程的的基因。主要研究結果如下:
　　1.以遺傳豐富的301份玉米自交系為材料，通過2014年和2015年兩個環(huán)境種植材料，授粉12天左右，選取幼胚大小在1.0～1.5mm的玉米材料挑取幼胚接種到含有2，4-D的誘導培養(yǎng)基上誘導胚性愈傷組織，于挑胚后第7天統計每個材料的芽長、出芽率，15，20，25天調查胚性愈傷組織誘導率。經過統計后發(fā)現其中胚性愈傷組織誘導率在40％～80％的

4、材料有3個，30％～40％的材料有3個，20％～30％的材料有12個，10％～20％的材料有25個，0％～10％的材料有69個，0％的材料有188個。
　　2.采用44243個最小等位基因頻率大于5％的高質量SNP，結合群體結構、親緣關系通過TASSEL軟件進行全基因組關聯分析。兩個環(huán)境下共檢測到25個SNP與胚性愈傷組織顯著相關(P＜0.0001)，其中僅有1個兩環(huán)境下共性SNP分布于玉米染色體bin1.05，25個SNP共篩選

5、到15個候選基因。根據基因注釋功能發(fā)現這些候選基因可能參與蛋白結合、ATP結合、線粒體構成、電子傳遞、蛋白激酶活性等生理生化過程。另外對出芽率和芽長也進行全基因組關聯分析，兩個環(huán)境下共檢測到36個SNP與出芽率顯著相關，其中共同檢測到與出芽率顯著相關的SNP10個，28個SNP篩選到20個候選基因。根據基因注釋功能發(fā)現這些候選基因可能參與轉移酶活性，蛋白激酶活性，能量傳遞及異構酶活性等功能。另外兩個環(huán)境下共檢測到53個SNP與芽長顯著相

6、關，共同檢測到與芽長顯著相關的SNP6個，31個SNP篩選到31個候選基因，根據基因注釋功能發(fā)現這些候選基因可能與磷酸轉移反應調節(jié)因子活性，解旋酶活性，甲基轉移酶活性，氧化還原酶活性及水解酶活性等功能相關。
　　3.以高誘導率自交系18-599為材料，將幼胚胚性愈傷組織誘導過程劃分為胚膨大期、初級愈傷形成期、胚性愈傷組織形成期，利用數字表達譜(DGE)測序進行基因表達分析，結果表明未培養(yǎng)幼胚(CK)、幼胚膨大期(StageⅠ)、初

7、級愈傷組織形成期(StageⅡ)、胚性愈傷組織形成期(StageⅢ)分別有18951(14.55％)，18359(56.42％)，18140(15.83％)，17870(15.5％)測序標簽可以比對到玉米基因組上;分別在3個培養(yǎng)階段檢測到4825、5119、5463個差異表達的基因;在3個階段存在超過5倍表達水平差異的基因中分別有199、230、250個基因是上調表達。而下調表達的基因比較稀少，在3個時期分別僅有52、94、63個基因。

8、說明在玉米幼胚胚性愈傷組織誘導過程激活了大量基因的表達。
　　4.COG分子功能注釋結果顯示，差異表達基因主要參與細胞構成，信號轉導，生理代謝等生物過程。KEGG Pathway分析結果表明StageⅠ中差異表達基因主要富集在脂肪酸生物合成，細胞色素代謝外源性物質，α—亞麻酸新陳代謝途徑，StageⅡ中差異表達基因主要富集在丙酮酸鹽代謝，植物激素的生物合成，脂肪酸的生物合成，StageⅢ中差異表達基因主要富集在丙酮酸鹽代謝，糖酵解

9、/糖原異生，苯丙素類生物合成。另外，植物激素信號傳導通路也是三個階段均檢測到的顯著通路。
　　5.本研究通過關聯分析研究遺傳豐富的301份玉米自交系材料胚性愈傷組織率，篩選與胚性愈傷組織誘導率相關基因，同時通過數字基因表達譜研究高胚性愈傷組織誘導率材料18-599R幼胚（對照），1～5天(StageⅠ)、6～10天(StageⅡ)、11～15天(StageⅢ)材料，尋找幼胚在脫分化時期的差異表達基因。將通過關聯分析篩選得到的相關候

10、選基因與差異表達基因進行對比，發(fā)現與三個性狀顯著關聯的相關候選基因有一部分也能在差異表達基因中找到。這些共性基因將是后續(xù)實驗關注的重點。
　　6.我們對植物激素信號傳導通路中由MYB138介導的GA信號傳導通路進行了初步的驗證，發(fā)現外源GA3通過促進玉米幼胚不定芽的生長而抑制胚性愈傷組織的誘導。ZmMYB138基因的擬南芥同源基因突變體atmyb65比野生型COL胚性愈傷組織誘導率下降了約20％，這部分葉片組織在誘導過程中產生變態(tài)