農(nóng)桿菌介導(dǎo)的燦粳稻轉(zhuǎn)化差異—胚性愈傷的侵染特性與全基因組表達差異研究.pdf

1、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為當(dāng)今植物分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究和現(xiàn)代遺傳育種應(yīng)用研究領(lǐng)域中不可或缺的重要手段和方法之一。經(jīng)過多年的努力，人們已建立和完善了多種植物遺傳轉(zhuǎn)化方法，在多種植物中成功實現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)化。其中，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物基因遺傳轉(zhuǎn)化是使用最為廣泛的一種方法。但是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法具有受體基因型依賴性，使之不能有效地轉(zhuǎn)化很多優(yōu)良作物品種。
　　 作為單子葉模式植物，水稻在基礎(chǔ)科研和糧食安全中的地位自是不言而喻。同時，它也是首個建立農(nóng)桿菌介

2、導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因體系的禾本科作物。在此基礎(chǔ)上，其他作物的轉(zhuǎn)化體系才相繼建立。但是經(jīng)過多年的努力，大部分秈稻品種的轉(zhuǎn)化效率依然較低，大大限制了秈稻特異基因的功能研究和秈稻品種的轉(zhuǎn)基因遺傳改良?，F(xiàn)在人們已經(jīng)意識到，僅僅通過優(yōu)化組培條件已不能克服秈稻轉(zhuǎn)化效率低下的問題，進一步提高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵在于侵染相關(guān)植物基因的利用，這就需要我們了解農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染過程，搞清楚植物細(xì)胞對農(nóng)桿菌侵染的反應(yīng)。
　　 本研究以不同粳稻和秈稻品種為轉(zhuǎn)化受體，比較

3、了它們對農(nóng)桿菌侵染的敏感性的差異：并利用生物芯片方法，檢測在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染過程中，粳稻與秈稻代表品種之間的基因表達差異，以期找到在兩個亞種間呈現(xiàn)差異表達的基因。本研究獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.不同粳稻品種間轉(zhuǎn)化效率的差別是由T-DNA整合效率的差別引起的。與粳稻相比，在農(nóng)桿菌侵染過程中，秈稻每一步的效率都要低一些，因此秈稻的短暫侵染效率和穩(wěn)定侵染效率都比粳稻的低。但秈稻中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的限速步驟依然是T-DNA

4、整合。
　　 2.選取了2個具有代表性的粳稻和秈稻品種--日本晴(Nip)和珍汕97(ZS)，對其成熟胚來源的胚性愈傷分別用農(nóng)桿菌進行侵染，在侵染前及侵染后1小時、6小時、12小時、24小時分別取樣，檢測其全基因組水平的基因表達情況。基因組DNA(gDNA)雜交分析表明，Nip和ZS在侵染過程中對農(nóng)桿菌敏感性的差異很可能不是由兩者之間基因組序列上的差異引起的，而是由基因表達上的差異造成的。
　　 3.雖然從RNA水平上說

5、在Nip愈傷里表達的基因更多，在Nip愈傷中特異表達的基因也比ZS中的多，但農(nóng)桿菌侵染后呈現(xiàn)差異表達的基因則是ZS愈傷中多一些。只有3，892個基因同時在兩個品種中差異表達，占總的差異表達基因數(shù)目(11，105)的35%。說明農(nóng)桿菌侵染對愈傷中基因表達的影響具有品種特異性。
　　 4.在Nip愈傷中，差異表達的基因多數(shù)為上調(diào)表達；而在ZS愈傷中有更多差異下降表達的基因，也有更多既差異下降表達又上調(diào)表達的基因。
　　 5.

6、大多數(shù)基因的差異表達變化發(fā)生在侵染的早期階段，就是侵染后6小時之內(nèi)。在侵染后最初6小時，既有一些基因上調(diào)表達，又有一些基因下降表達；接下來的18小時內(nèi)，農(nóng)桿菌侵染主要誘導(dǎo)基因下調(diào)表達，雖然最后12小時內(nèi)一些基因被上調(diào)表達。
　　 6.植物抗病防御相關(guān)基因在農(nóng)桿菌與水稻細(xì)胞互作的過程中發(fā)揮重要作用。它們在Nip和ZS愈傷中都既被誘導(dǎo)上升表達，也被抑制表達；但也有一些這類基因在Nip和ZS愈傷之間呈現(xiàn)差異表達。一些抗病基因在ZS愈傷

7、中很早就被誘導(dǎo)表達，或者一直處于激活狀態(tài)；但在Nip愈傷中則是被抑制表達的，這可能導(dǎo)致了兩者在侵染效率上的差異。
　　 7.一些與農(nóng)桿菌侵染直接相關(guān)的基因在Nip和ZS愈傷之間呈現(xiàn)差異表達。參與細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期，DNA復(fù)制、重組和修復(fù)，微管介導(dǎo)的運動，泛素-26S蛋白酶體降解系統(tǒng)，生長素刺激應(yīng)答及編碼組蛋白的基因在ZS愈傷中被強烈抑制表達；在Nip愈傷中，這些基因的表達水平?jīng)]有明顯的降低，有些還被誘導(dǎo)上升表達。這進一步降低了秈