鼻咽癌抑瘤基因BRD7的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究.pdf

1、溴區(qū)結(jié)構(gòu)(Bromodomain)是近年來發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于多種生物中的一種高度保守結(jié)構(gòu)域，可特異性地與組蛋白末端乙?；馁嚢彼嵛稽c(diǎn)結(jié)合。Bromodomain蛋白通過與乙?；M蛋白結(jié)合，改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象，協(xié)調(diào)多個轉(zhuǎn)錄復(fù)合物與染色質(zhì)模板的有序結(jié)合而參與信號依賴性基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。BRD7基因是利用cDNA代表性差異分析法篩選出的 Bromodomain基因。它在鼻咽癌細(xì)胞和組織中表達(dá)下調(diào)。前期研究工作表明：BRD7是一個細(xì)胞周期特異性轉(zhuǎn)錄相關(guān)因

2、子，一方面通過調(diào)節(jié)Ras/MEK/ERK和Rb/E2F信號通路中的關(guān)鍵分子而參與細(xì)胞周期調(diào)控，另一方面通過與乙?；M蛋白H3結(jié)合，參與核內(nèi)組蛋白乙?；盘杺鬟f。過表達(dá)BRD7基因可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，并部分地逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細(xì)胞的惡性表型。為了揭示BRD7基因在鼻咽癌細(xì)胞和組織中表達(dá)下調(diào)的分子機(jī)制，更深入地闡明BRD7基因的生物學(xué)功能，本課題展開了BRD7基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究。 【BRD7基因啟動子的克隆、鑒定及精細(xì)定位】

3、 生物信息學(xué)分析為基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究提供了一個很好的切入點(diǎn)。在線程序PromoterInspectot-分析結(jié)果表明BRD7調(diào)控區(qū)-375/+416的區(qū)間為其候選啟動子區(qū)，而在線程序PromoterScan的預(yù)測結(jié)果表明-391/-141的區(qū)間為BRD7的候選啟動子區(qū)。以正常人外周血細(xì)胞基因組DNA為摸板，利用PCR技術(shù)，獲得了BRD7調(diào)控區(qū)長片段-711/+496，并證實(shí)該區(qū)域具有與病毒SV40啟動子同等強(qiáng)度的啟動活性。進(jìn)一步以

4、該長片段調(diào)控區(qū)為模板，利用缺失突變體報告質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)和熒光素酶活性分析系統(tǒng)，定位了BRD7基因的近距離啟動子區(qū)-404/+46，并發(fā)現(xiàn)BRD7啟動子區(qū)-293/-168的125bp區(qū)域是其發(fā)揮啟動子活性的必需序列。 為了進(jìn)一步獲得BRD7基因的最小啟動子序列，分別在其近距離啟動子片段-404/+46的5'、3'或內(nèi)部缺失部分序列，構(gòu)建一系列缺失突變體報告載體，并將它們分別轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)BRD7基因-266/-212的55

5、bp區(qū)間為其最小啟動子區(qū)域，而且這一最小啟動子選擇性地在c-Myc缺失的細(xì)胞株中發(fā)揮啟動活性。 【BRD7啟動子區(qū)順式作用元件和反式作用因子的鑒定和功能研究】 真核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是一個非常復(fù)雜的生化反應(yīng)過程，數(shù)目驚人的蛋白因子參與了基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在線軟件MatInspector分析結(jié)果表明BRD7啟動子區(qū)是一個不含TATA盒，也不含CAAT盒的GC富集區(qū)。它含有多個GC盒，多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如：KLF，Spl，E2

6、F，MYC-MAX和AP2等結(jié)合位點(diǎn)。凝膠遷移率分析(EMSA)證實(shí)了BRD7基因啟動子區(qū)的Spl/MYC-MAX(-223/-198)、E2F-6(-243/-229)以及E2F(-183/-169)結(jié)合位點(diǎn)。超變動(Supershift Assay)和免疫染色質(zhì)共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了轉(zhuǎn)錄因子c-Myc、E2F6和Spl對這些位點(diǎn)的特異性結(jié)合。 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)c-Myc能大幅度地下調(diào)BRD7啟動子活性并明顯抑

7、制BRD7基因的內(nèi)源性mRNA表達(dá)水平；封閉內(nèi)源性c-Myc的表達(dá)使BRD7啟動子活性在鼻咽癌5-8F細(xì)胞中提高了10倍以上，同時也明顯上調(diào)了BRD7基因內(nèi)源性mRNA的表達(dá)水平。采用 MicroRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)，封閉內(nèi)源性c-Myc的表達(dá)在鼻咽癌細(xì)胞中上調(diào)了14個miRNA分子的表達(dá)，其中hsa-miR-224上調(diào)了66.49倍，是上調(diào)幅度最大的miRNA基因，同時還下調(diào)7個miRNA分子的表達(dá)，hsa-miR-200c和hsa-m

8、iR-141的表達(dá)下調(diào)了10倍以上。在線程序預(yù)測這些差異表達(dá)miRNA分子的靶基因，發(fā)現(xiàn)它們大多涉及細(xì)胞周期和凋亡等信號分子通路。 過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Spl以濃度依賴性方式在鼻咽癌細(xì)胞中上調(diào)BRD7啟動子活性，但并不足以使BRD7啟動子活性上調(diào)至全長啟動子-404/+46的活性；轉(zhuǎn)錄因子Spl結(jié)合位點(diǎn)的特異性競爭劑光輝酶素A(Mithramycin A)可大幅度地抑制BRD7啟動子活性，并明顯下調(diào)BRD7基因內(nèi)源性mPNA表達(dá)水平。

9、但轉(zhuǎn)錄因子E2F6對BRD7基因最小啟動子片段沒有活性調(diào)節(jié)作用。 為了進(jìn)一步確定BRD7啟動子區(qū)-223/-198的MYC-MAX/Spl重疊結(jié)合位點(diǎn)和-243/-229的E2F6結(jié)合位點(diǎn)的重要性，分別構(gòu)建了這兩個結(jié)合位點(diǎn)的點(diǎn)突變和缺失突變報告基因載體。熒光素酶分析系統(tǒng)結(jié)果表明：突變MYC-MAX/Spl(-223/-198)重疊結(jié)合位點(diǎn)中的三個關(guān)鍵堿基(C/A，G/T，G/A)使BRD7最小啟動子活性在鼻咽癌5-8F細(xì)胞中增加

10、了4個數(shù)量級；但缺失MYC-MAX/Spl結(jié)合位點(diǎn)并不影響B(tài)RD7最小啟動子的活性。而突變E2F6結(jié)合位點(diǎn)的4個關(guān)鍵堿基不影響B(tài)RD7最小啟動子活性，但缺失E2F6結(jié)合位點(diǎn)的15個關(guān)鍵堿基卻大幅度地增加了BRD7最小啟動子活性。 另外，免疫共沉淀和免疫共定位實(shí)驗(yàn)都確證了鼻咽癌5-8F細(xì)胞中蛋白因子c-My與Spl的直接交互作用，提示蛋白因子c-Myc結(jié)合于Spl從而競爭或覆蓋了Spl與其相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合的基序可能是c-Myc抑制BR

11、D7啟動子活性和內(nèi)源性表達(dá)的另一調(diào)節(jié)因素。 【DNA甲基化抑制BRD7基因的表達(dá)，去甲基化恢復(fù)其表達(dá)】 c-Myc和Spl對BRD7啟動子活性調(diào)節(jié)至關(guān)重要，但在鼻咽癌細(xì)胞中抑制c-Myc的表達(dá)或過表達(dá)Spl蛋白因子都不足以使BRD7最小啟動子活性上調(diào)至全長啟動子-404/+46的性或完全恢復(fù)BRD7基因的mRNA表達(dá)水平，提示在BRD7基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制中還存在未知的調(diào)節(jié)因素如：CpG島或Spl結(jié)合位點(diǎn)甲基化等。利用歐洲分

12、子生物學(xué)開放軟件包(EMBOSS)和美國softberry軟件公司推出的CpGFinder程序在線掃描BRD7基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp的gDNA序列，分別發(fā)現(xiàn)其5'上游-418/-56或-374/-4的區(qū)間為一CpG島。這兩個軟件的預(yù)測結(jié)果大部分重疊，且與BRD7近離啟動子-404/+46重疊。利用BRD7基因啟動子區(qū)特異性甲基化和非甲基化引物進(jìn)行甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP-PCR)，發(fā)現(xiàn)BRD7啟動子在所有鼻咽癌細(xì)胞系中

13、都呈部分甲基化狀態(tài)，且其甲基化程度與BRD7基因mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。MSP-PCR測序結(jié)果表明BRD7基因啟動子區(qū)共有10個甲基化CpG位點(diǎn)，它們分別涉及位于-353/-337的Spl結(jié)合位點(diǎn)、-330/-317的Spl結(jié)合位點(diǎn)、-260/-246的MYC-MAX結(jié)合位點(diǎn)、-223/-198的Spl結(jié)合位點(diǎn)以及-243/-229的E2F結(jié)合位點(diǎn)，另有兩個位于翻譯起始位點(diǎn)ATG的附近。利用SssI甲基轉(zhuǎn)移酶能將腺苷甲硫氨酸(H.S

14、AM)中的甲基轉(zhuǎn)移至基因組DNA CpG位點(diǎn)的非甲基化胞嘧啶"C"上，使原本未甲基化的"C"發(fā)生甲基化的特點(diǎn)，分別將野生型雙鏈寡核苷酸探針Wt E2F-6(-243/-229)和WtSpl/MYC-MAX(-223/-198)經(jīng)SssI甲基轉(zhuǎn)移酶處理后，進(jìn)行EMSA分析，發(fā)現(xiàn)這些甲基化的寡核苷酸探針不能與核蛋白結(jié)合。同樣，將BRD7啟動子報告載體pGL3-404/+46、pGL3-404/+46/GFP經(jīng)SssI甲基轉(zhuǎn)移酶處理后，發(fā)現(xiàn)它

15、們在COS7和BHK-21細(xì)胞以外的所有癌細(xì)胞株中喪失了全部的啟動子活性。 3.75μM的甲基化酶抑制劑5-脫氧雜氮胞苷(ADC)就足以在鼻咽癌5-8F細(xì)胞中完全逆轉(zhuǎn)BRD7啟動子甲基化狀態(tài)，并最大幅度地上調(diào)BRD7基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，其上調(diào)幅度分別為76.7％和63.3％。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明，3.75μM的5-脫氧雜氮胞苷具有阻滯鼻咽癌細(xì)胞周期G2/M、S期進(jìn)程和誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的作用。MicroRNA芯片分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)

16、，3.75μM的5-脫氧雜氮胞苷在鼻咽癌5-8F細(xì)胞中上調(diào)了10個miRNA分子的表達(dá)，其中hsa-miR-122a上調(diào)了63.2倍，是上調(diào)幅度最大的miRNA分子，同時還下調(diào)7個miRNA分子的表達(dá)，其中hsa-miR-203下調(diào)了7.79倍。利用在線程序預(yù)測其靶基因，發(fā)現(xiàn)這些靶基因主要涉及細(xì)胞周期和凋亡等信號分子通路。 更為重要的是：通過檢測36例鼻咽癌病人組織和16例正常人外周血細(xì)胞中BRD7基因的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)BRD7

17、基因啟動子區(qū)的甲基化頻率在鼻咽癌病人的鼻咽組織中為100％，而在正常人群外周血細(xì)胞中為50％，且在正常人群中呈微弱甲基化狀態(tài)?？傊?，通過本課題研究，獲得了BRD7啟動子及其精細(xì)位置，較系統(tǒng)地闡述了BRD7啟動子的特征及其順式作用元件和反式作用因子的組成和功能，較詳細(xì)地探索了DNA甲基化對BRD7啟動子活性、mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響及分子機(jī)制，并獲得了BRD7基因啟動子甲基化可能成為界定鼻咽癌病人和正常人群的生物分子標(biāo)志物之一的重要