BRD7與AP3δ蛋白的交互作用及溴區(qū)結(jié)構(gòu)域?qū)RD7功能影響的初步研究.pdf

1、Bromodomain是一進(jìn)化上高度保守的功能域，存在于許多轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)中。我們實驗室在1997年運用cDNA代表性差異分析法克隆了一個在鼻咽癌活檢組織中表達(dá)下調(diào)的新的bromodomain基因BRD7。功能研究表明BRD7可能參與了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，是一個潛在的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)BRD7可能是通過Ras/MEK/ERK和Rb/E2F兩條通路影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，使細(xì)胞停滯于G0/G1期。對BRD7在鼻咽癌中的研究表明，

2、BRD7的過表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長和細(xì)胞周期的進(jìn)程。通過酵母雙雜交技術(shù)從人胎腦的cDNA文庫中篩選出6個與BRD7存在交互作用的蛋白：接頭相關(guān)蛋白復(fù)合物3δ亞單位(adaptor-relatedproteincomplex3δ，AP3δ)蛋白，BRD2蛋白、BRD3蛋白、β-IkB激酶、KIAA1375蛋白和IL-7蛋白。其中BRD2蛋白、BRD3蛋白與BRD7蛋白的交互作用已經(jīng)通過免疫共沉淀技術(shù)得到了進(jìn)一步的證實，同時發(fā)現(xiàn)BRD7

3、可能影響B(tài)RD2、BRD3在mRNA上的表達(dá)水平，它們在功能上密切關(guān)聯(lián)，可能共同參與了鼻咽癌的發(fā)病過程。 本研究首先考察了BRD7的亞細(xì)胞定位以及bromodomain結(jié)構(gòu)域?qū)RD7亞細(xì)胞定位的影響，并初步探討了bromodomain結(jié)構(gòu)域?qū)RD7轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的影響。 我們構(gòu)建了bromodomain缺失型的BRD7重組體pCMV-Myc/BRD7△brd和pEGFP-C2/BRD7△brd,利用GFP介導(dǎo)的亞細(xì)胞定

4、位方法和Myc靶介導(dǎo)的間接免疫熒光方法，觀察到BRD7在COS7細(xì)胞中主要定位在細(xì)胞核，與染色質(zhì)的分布存在一定程度的相似性；而bromodomain結(jié)構(gòu)域的缺失并不影響B(tài)RD7的細(xì)胞核分布，但是其在核內(nèi)的分布模式發(fā)生了一定的改變。同時通過熒光素酶報告基因分析法檢測到無論是野生型BRD7還是缺失bromodomain結(jié)構(gòu)域的BRD7突變體均能夠使Wnt通路末端分子TCF的啟動子活性下調(diào)，并且下調(diào)的程度沒有明顯差別。說明bromodomai

5、n結(jié)構(gòu)域?qū)τ贐RD7對Wnt通路的調(diào)節(jié)作用并沒有顯著影響。 大量文獻(xiàn)顯示，如果兩種蛋白存在交互作用，那么它們在功能上也密切關(guān)聯(lián)，共同參與某一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或疾病發(fā)病過程。為此本研究在我室前期的工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步證實了BRD7蛋白與AP3δ蛋白的交互作用，并對兩者功能上的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了初步的研究。 首先我們使用細(xì)胞熒光共定位技術(shù)觀察到BRD7和AP3δ蛋白共同定位于細(xì)胞核，并通過免疫共沉淀直接證實了兩者的交互作用，同時我們觀察到

6、溴區(qū)結(jié)構(gòu)域?qū)RD7和AP3δ的細(xì)胞同定位沒有明顯的影響。然后利用半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(semi-quantityRT-PCR)技術(shù)檢測到在鼻咽癌HNE1細(xì)胞中，隨著BRD7表達(dá)水平的上調(diào)，AP3δ基因的表達(dá)也有明顯增強，提示BRD7能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞中AP3δ基因的表達(dá)。同時通過熒光素酶報告基因分析法檢測了BRD7及AP3δ對Rb/E2F信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的兩個關(guān)鍵分子E2F3和CyclinDl啟動子活性的影響。發(fā)現(xiàn)BRD7單獨作用可以使這