BRD7蛋白的抗體制備和其在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義.pdf

1、BRD7的研究背景
　　 BRD7是我室新近克隆的鼻咽癌相關(guān)基因，是一個(gè)含Bromodomain的核轉(zhuǎn)錄因子。BRD7基因的過表達(dá)可通過調(diào)節(jié)MAPK及Wnt信號通路抑制鼻咽癌的生長，并將鼻咽癌阻滯在G1/S期。前期研究表明，BRD7不僅在鼻咽癌活檢組織中表達(dá)下調(diào)，RT—PCR結(jié)果顯示BRD7在結(jié)直腸癌細(xì)胞中也表現(xiàn)出明顯的下調(diào)。因此，本文在前期工作基礎(chǔ)上，通過制備BRD7抗體，進(jìn)一步分析BRD7在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義。

2、r>　　 GST-BRD7N融合蛋白的表達(dá)與純化
　　 從人胎腦文庫PCR擴(kuò)增編碼BRD7蛋白N端353個(gè)氨基酸的BRD7基因片段，定向克隆到原核表達(dá)載體pGEX-4T—1。陽性重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和測序鑒定，導(dǎo)入大腸桿菌BL21原核表達(dá)系統(tǒng)。37℃0.5mM IPTG誘導(dǎo)細(xì)菌3.5小時(shí)，BL21高效表達(dá)預(yù)期的64kDa GST-BRD7N融合蛋白。親和層析純化后，純化蛋白的總量超過2 mg/600μl。純化蛋白的濃度為1.5 m

3、g/ml。在純化過程中，GST—BRD7N蛋白沒有發(fā)生降解，保持了完整性。
　　 抗BRD7多克隆抗體的制備
　　 用純化的GST-BRD7N融合蛋白對兩只新西蘭兔共進(jìn)行了5次免疫。在初次免疫100天后，收集抗血清，進(jìn)行親和純化。ELISA結(jié)果表明，純化的兔抗BRD7抗體的滴度為1：1，000，000。SDS—PAGE結(jié)果顯示，兩只兔子的BRD7抗體的濃度分別為300μg/ml和150μg/ml。純化的BRD7抗體特異識(shí)

4、別pCMV—Myc—BRD7轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞中分子量為75kDa的全長重組融合蛋白Myc—BRD7。為進(jìn)一步研究BRD7抗體的特異性，我們還進(jìn)行了免疫沉淀分析。在由BRD7抗體沉淀的免疫復(fù)合物中，用c—Myc抗體檢測到了Myc—BRD7蛋白的表達(dá)。同樣，在由c—Myc抗體沉淀的免疫復(fù)合物中，用BRD7抗體也檢測到了Myc—BRD7蛋白的表達(dá)。
　　 用抗BRD7抗體檢測人胚胎組織中BRD7蛋白的組織表達(dá)譜
　　 分別采用

5、Western blot和免疫組化方法，分析了BRD7基因在11種人胚胎組織中的蛋白表達(dá)情況。Western blot結(jié)果顯示，BRD7在大多數(shù)所檢測人胚胎組織中表達(dá)。比較不同組織BRD7蛋白表達(dá)水平，BRD7蛋白在小腦、心肌、胰臟相對高表達(dá)，在腸、肝、腎中度表達(dá)，而在大腦、肺、脾、胃相對低表達(dá)。免疫組化實(shí)驗(yàn)表明，BRD7蛋白在心肌呈強(qiáng)陽性表達(dá)，且主要位于細(xì)胞漿，而在小腦、胰、腸、肝、腎、大腦、肺、脾、胃則主要分布在細(xì)胞核，其中，小腦、

6、胰、腸、肝、腎為強(qiáng)陽性表達(dá)，大腦、肺、脾、胃為弱陽性表達(dá)。
　　 結(jié)直腸癌組織微陣列的制作
　　 成功制作了包括103例原發(fā)性結(jié)直腸癌病人腫瘤組織和103例配對正常結(jié)直腸上皮組織的結(jié)直腸癌組織微陣列。每例標(biāo)本設(shè)置3個(gè)平行組織點(diǎn)，組織直徑0.5mm。組織微陣列切片經(jīng)HE染色，鏡下觀察切片質(zhì)量。結(jié)果證實(shí)切片厚度適中，細(xì)胞形態(tài)均一，組織結(jié)構(gòu)無破壞。
　　 結(jié)直腸癌BRD7蛋白表達(dá)及其臨床意義
　　 采用高通量的

7、組織芯片和免疫組化技術(shù)相結(jié)合的方法，對102例結(jié)直腸癌組織和99例匹配正常結(jié)直腸上皮組織BRD7蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測分析。免疫組化陽性的多數(shù)樣本(75％)BRD7蛋白主要定位分布在胞核。20％樣本BRD7蛋白在胞核和胞漿中均有陽性表達(dá)。約5％免疫組化陽性樣本BRD7蛋白只在胞漿中表達(dá)分布。73例(71.6％)結(jié)直腸癌和84例(84.9％)配對正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞中BRD7蛋白表達(dá)陽性。和配對正常結(jié)直腸上皮組織比較，結(jié)直腸癌組織樣本中B

8、RD7蛋白陽性表達(dá)率顯著下調(diào)(p=0.023)。
　　 進(jìn)一步分析BRD7蛋白表達(dá)水平和結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌BRD7蛋白表達(dá)缺失與腫瘤大小、Ducks分期、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)：①腫瘤直徑≥4.0cm的病人組織樣本中BRD7蛋白陽性表達(dá)率明顯下調(diào)，BRD7蛋白在直徑≥4.0 cm腫瘤中陽性表達(dá)率為64.8％，而在直徑<4.0cm腫瘤中BRD7蛋白陽性表達(dá)率為87.1％(p=0.031)；②結(jié)直腸癌D

9、ucks分期中，C期(62.0％)和D期(64.0％)的BRD7蛋白陽性表達(dá)率顯著低于A期(92.9％)和B期(76.5％)(p=0.041)；③TNM分期中，臨床Ⅲ期的結(jié)直腸癌(64.2％)組織樣本中BRD7蛋白陽性表達(dá)率明顯低于臨床Ⅰ期(100％)和臨床Ⅱ期(80.0％)(p=0.041)；④伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(62.0％)的結(jié)直腸癌組織中BRD7蛋白陽性表達(dá)率顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織(80.8％)(p=0.036)。而BRD7

10、蛋白表達(dá)水平和結(jié)直腸癌分化水平、腫瘤位置、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病人性別以及病人年齡無關(guān)(p>0.05)。
　　 綜上所述，本文首次研究了BRD7基因在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。通過構(gòu)建pGEX-4T—RD7N重組原核表達(dá)載體，獲得了純化的原核誘導(dǎo)表達(dá)的GST-BRD7N融合蛋白；通過免疫新西蘭兔和免疫吸附實(shí)驗(yàn)，制備了高效價(jià)和高特異性的抗BRD7多克隆抗體，應(yīng)用該抗體，檢測分析了人胚胎BRD7的組織表達(dá)譜；借助成功制作的結(jié)直腸癌