人源arap3rpharfgap人源eea6a的see7及e.蛋白cm結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)研究

1、 I 摘 要 小 GTP 酶是一類單體的 G 蛋白，通過在活性態(tài)和非活性態(tài)之間的轉(zhuǎn)換，參與細(xì)胞信號(hào)的調(diào)控。 GTP 酶激活蛋白(GTPase–activating proteins,GAPs)和 GTP 酶鳥苷酸交換因子(Guanine-nucleotide exchange factors,GEFs)共同參與調(diào)節(jié)這一轉(zhuǎn)換， 前者促進(jìn)小GTP 酶水解，后者幫助小 GTP 酶結(jié)合 GTP。 hArap3 是具有 ArfGAP 和 Rh

2、oGAP 的雙 GAP 活性的激活蛋白。 hArap3 有 9 個(gè)結(jié)構(gòu)域，包含 1 個(gè) SAM、5 個(gè) PH、 1 個(gè) ArfGAP、1 個(gè) RhoGAP 和 ANK 重復(fù)結(jié)構(gòu)域。它在細(xì)胞扁平偽足的形成， 細(xì)胞的遷移， 細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞質(zhì)膜的運(yùn)輸過程中發(fā)揮著重要的作用。 根據(jù)前期的研究成果:邊界為 329-641 氨基酸殘基的 Tev-PH-ArfGAP結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中高效表達(dá)， 但無法得到適合核磁三共振實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)樣品。 通過優(yōu)

3、化表達(dá)載體獲得 Thrombin-PH-ArfGAP 融合蛋白，其酶切效率相較 于前期Tev-PH-ArfGAP 的 10h 酶切 40%提高到 4h 酶切 100%，且無需二次 Ni-NTA 柱純化。PH-ArfGAP 對(duì)于溫度較為敏感，這些改善減少了核磁樣品的純化流程和時(shí)間，有利于提高其在收集核磁數(shù)據(jù)時(shí)的穩(wěn)定性。 隨后的 1H,15N HSQC 實(shí)驗(yàn)表明重組表達(dá)的目的蛋白具有一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過 PH-ArfGAP 和 Arf6 的

4、核磁滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在PH-ArfGAP 的 1H,15N HSQC 譜圖中，有部分交叉峰消失或移動(dòng)，二者是否有相互作用還在進(jìn)一步探索中。運(yùn)用核磁三共振技術(shù)收集了有效的數(shù)據(jù)，PH-ArfGAP 的主鏈化學(xué)位移認(rèn)證工作已經(jīng)完成。 作為 Arf6 的 GEF，hEFA6A 蛋白對(duì) Arf6 有高度的選擇性和親和性。它參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膜的循環(huán)， 引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組， 調(diào)控樹突棘的發(fā)育和鞏固。 hEFA6A全長(zhǎng) 1024 個(gè)氨基酸，包括

5、1 個(gè) PH，1 個(gè) Sec7，2 個(gè)富含脯氨酸區(qū)域和一個(gè)無規(guī)則卷曲的區(qū)域， Sec7 結(jié)構(gòu)域起核心的 GEF 催化作用， PH 結(jié)構(gòu)域起定位于質(zhì)膜的作用。 本研究在大腸桿菌中原核表達(dá) Sec7(497-719)結(jié)構(gòu)域，初次表達(dá)純化，發(fā)現(xiàn)目的蛋白降解嚴(yán)重。通過分析 Uniprot，Jpred，NCBI，Expript 的比對(duì)和預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇 7 種不同邊界的殘基：Sec7(481-719)、Sec7(467-719)、Sec7(497-

6、726)、Sec7(467-734)、Sec7(530-719)、Sec7(519-719)、Sec7(506-719)來探索結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性。經(jīng)過 Ni-NTA柱和 Superdex200 柱純化， SDS-PAGE 電泳檢測(cè)結(jié)果表明: Sec7(530-719)在室溫下 18d天后無明顯的降解。 隨后的 1H,15N HSQC 實(shí)驗(yàn)表明重組表達(dá)的 Sec7(530-719) 具有一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)且溶液狀態(tài)良好，為其后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。