microRNAs在HIFU增強(qiáng)小鼠抗黑色素瘤免疫中的作用及機(jī)制探討.pdf

1、研究背景和目的：
　　高強(qiáng)度聚焦超聲(HIFU)是一種新興的治療實(shí)體腫瘤的非侵入性技術(shù)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，HIFU不僅能夠破壞原發(fā)腫瘤、減少遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，還能增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫。但是，其機(jī)制尚未闡明。
　　microRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼RNA，通過與目標(biāo)mRNA的3'UTR序列互補(bǔ)配對(duì)，調(diào)控靶基因的表達(dá)或翻譯，參與生物體的各種生命活動(dòng)。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs參與免疫細(xì)胞的分化、增殖及激活過程，在機(jī)

2、體的免疫應(yīng)答與免疫耐受中均起著十分重要的作用。因此，我們假設(shè) miRNAs參與HIFU增強(qiáng)抗腫瘤免疫的作用，并基于文獻(xiàn)篩選出8個(gè)與免疫密切相關(guān)的miRNAs作為研究對(duì)象，包括miR-34,miR-106a,miR-126a,miR-134,miR-155,miR-181a,miR-221和miR-222；構(gòu)建HIFU輻照黑色素瘤的小鼠模型，在驗(yàn)證HIFU增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫后，通過qRT-PCR、生物信息學(xué)、熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)等多種方法篩選

3、、鑒定HIFU處理引起的脾臟及黑色素瘤組織或細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs，分別探討它們?cè)贖IFU增強(qiáng)小鼠抗黑色素瘤免疫中的作用及機(jī)制，為進(jìn)一步闡明HIFU增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫的機(jī)制和促進(jìn) HIFU在黑色素瘤的臨床治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.構(gòu)建HIFU輻照黑色素瘤的小鼠模型及觀察HIFU增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫的作用
　　1）構(gòu)建C57BL/6J小鼠黑色素瘤B16的皮下移植瘤模型，隨機(jī)分HIFU組

4、與假照組，HIFU組用9.3MHz、4.5W的HIFU腫瘤治療系統(tǒng)進(jìn)行治療，假照組進(jìn)行假照處理，后續(xù)處理如下：
　?。?）取輻照后即刻的腫瘤組織，包埋、切片及HE染色，觀察輻照靶區(qū)消融效果；
　　（2）輻照7天后，尾靜脈注射B16單細(xì)胞懸液200ul(1×106個(gè)細(xì)胞）/鼠，繼續(xù)飼養(yǎng)至自然死亡。期間，監(jiān)測(cè)瘤體體積；死后計(jì)數(shù)肺部腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)及計(jì)算累積生存率；
　?。?）輻照后14天，用qRT-PCR檢測(cè)外周血中黑色素瘤細(xì)

5、胞標(biāo)志物MAGE和Melan-A的mRNA，ELISA檢測(cè)小鼠血清中的IFN-γ及TNF-α。
　　2）將HIFU組與假照組小鼠的脾淋巴細(xì)胞分別與B16細(xì)胞共培養(yǎng)，采用細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞對(duì)B16細(xì)胞的殺傷活性，ELISA檢測(cè)共培養(yǎng)上清中的IFN-γ及TNF-α。
　　2.HIFU引起的脾組織中差異表達(dá)的microRNAs的篩選及靶基因鑒定
　　1）qRT-PCR檢測(cè)HIFU組與假照組的脾組織中的差異miRNAs

6、。
　　2）用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)差異miRNAs的潛在靶基因。
　　3）RT-PCR及Western blot驗(yàn)證脾組織中miRNAs潛在靶基因的表達(dá)。
　　4）構(gòu)建熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，驗(yàn)證差異miRNAs與潛在靶基因之間的直接調(diào)控關(guān)系。
　　5）將差異miRNAs的mimics轉(zhuǎn)染脾淋巴細(xì)胞，用RT-PCR及Western blot檢測(cè)其靶基因的變化，以進(jìn)一步確認(rèn)其對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控。
　　3.HIFU引起

7、的黑色素瘤組織及細(xì)胞中差異表達(dá)的microRNAs的篩選、靶基因鑒定及其在HIFU增強(qiáng)抗黑色素瘤免疫中的作用及機(jī)制探討
　　1）qRT-PCR檢測(cè)HIFU組與假照組腫瘤組織中的差異miRNAs。
　　2）用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)差異miRNAs的潛在靶基因，通過RT-PCR及Western blot驗(yàn)證腫瘤組織中靶基因的表達(dá)。
　　3）構(gòu)建熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，驗(yàn)證差異miRNAs對(duì)潛在靶基因的直接調(diào)控作用。
　　4）再

8、將差異miRNAs的mimics轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞，RT-PCR及Western blot檢測(cè)其靶基因的變化，以進(jìn)一步確認(rèn)差異其對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控。
　　5）采用HIFU腫瘤治療系統(tǒng)輻照B16細(xì)胞：
　?。?）檢測(cè)輻照后B16細(xì)胞中差異表達(dá)miRNA及靶基因的水平。
　?。?）共培養(yǎng)輻照后的B16細(xì)胞與B16細(xì)胞預(yù)激活的脾淋巴細(xì)胞，采用細(xì)胞毒試驗(yàn)檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞對(duì)B16細(xì)胞的殺傷活性，ELISA檢測(cè)共培養(yǎng)上清中的IFN-γ及

9、TNF-α。
　　6）用siRNA干擾B16細(xì)胞中差異miRNA的靶基因表達(dá)，再進(jìn)行HIFU輻照；輻照后的B16細(xì)胞與激活的脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞對(duì)B16細(xì)胞的殺傷活性。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.HIFU能有效治療黑色素瘤，并提高機(jī)體抗黑色素瘤的免疫力。
　　1)HIFU輻照立即引起靶區(qū)腫瘤組織發(fā)生凝固性壞死；輻照11天后，HIFU組瘤體體積開始小于假照組，且隨飼養(yǎng)時(shí)間延長，其統(tǒng)計(jì)學(xué)差異更加明

10、顯；HIFU組肺部腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)明顯少于假照組（P<0.01），累積生存率明顯高于假照組（P<0.01）。
　　2)輻照14天后，HIFU組外周血中黑色素瘤細(xì)胞標(biāo)志物 MAGE和Melan-A的mRNA水平明顯降低（P<0.01）；免疫效應(yīng)因子IFN-γ的水平增加（P<0.05），TNF-α也呈增加趨勢(shì)（P>0.05）。
　　3)HIFU輻照增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞對(duì) B16細(xì)胞的殺傷活性（P<0.05），增加脾淋巴細(xì)胞與 B16細(xì)胞共

11、培養(yǎng)上清中的IFN-γ（P<0.05）及TNF-α（P>0.05）的水平。
　　2．HIFU輻照能夠下調(diào)脾臟中miR-181a的表達(dá)，并因此上調(diào)免疫共刺激分子ICAM-1的表達(dá)。
　　1）HIFU組小鼠脾組織中miR-181a的水平明顯低于對(duì)照組（P<0.01）。
　　2)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)出共刺激分子ICAM-1是miR-181a的潛在靶基因。
　　3）HIFU組脾組織中ICAM-1的mRNA（P<0.01）

12、和蛋白質(zhì)（P<0.01）均明顯高于對(duì)照組。
　　4)miR-181a mimics顯著抑制pLUC-ICAM-1-3ˊUTR報(bào)告質(zhì)粒中熒光素酶的活性（P<0.01），并下調(diào)脾淋巴細(xì)胞中ICAM-1的mRNA（P<0.05）和蛋白質(zhì)的表達(dá)（P<0.01）。證明miR-181a負(fù)調(diào)控ICAM-1。
　　3.HIFU輻照通過抑制B16黑色素瘤細(xì)胞中miR-134對(duì)CD86表達(dá)的負(fù)向調(diào)控作用，從而增強(qiáng)抗黑色素瘤的免疫效應(yīng)。
　

13、　1)HIFU組腫瘤組織中miR-134（P<0.01）和miR-222（P<0.01）明顯低于對(duì)照組。
　　2)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)出CD86和ICAM-1分別是miR-134和miR-222的潛在靶基因。
　　3）HIFU組腫瘤組織中：
　?。?）CD86的mRNA（P<0.05）和蛋白質(zhì)（P<0.05）高于對(duì)照組；
　?。?）ICAM-1的mRNA（P<0.01）和蛋白質(zhì)（P<0.01）明顯高于對(duì)照組。

14、r>　　4）miR-134 mimics顯著抑制pLUC-CD86-3ˊUTR報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性，并下調(diào)B16細(xì)胞中CD86的mRNA（P<0.05）和蛋白質(zhì)（P<0.05）；但，miR-222不能抑制pLUC-ICAM-1-3ˊUTR報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性。提示miR-134負(fù)調(diào)控CD86，miR-222對(duì)ICAM-1無調(diào)控作用。
　　5) HIFU輻照的B16細(xì)胞中miR-134的水平降低，CD86的水平增加，且miR-1

15、34與CD86呈負(fù)相關(guān)。
　　6）將HIFU輻照后的B16細(xì)胞與正常脾淋巴細(xì)胞（已用B16細(xì)胞激活）進(jìn)行體外共培養(yǎng)24 h和48 h后：
　?。?）HIFU組B16細(xì)胞存活率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；
　?。?）HIFU組共培養(yǎng)上清中IFN-γ和TNF-α高于對(duì)照組，且隨著輻照時(shí)間的增加而增加（P<0.05）。
　　7) CD86 siRNA增加B16細(xì)胞的存活率（P<0.01）。提示CD86的下調(diào)可抑制脾

16、淋巴細(xì)胞對(duì)B16細(xì)胞的殺傷活性，
　　結(jié)論：
　　1.HIFU輻照能夠使靶區(qū)腫瘤組織發(fā)生凝固型壞死、抑制腫瘤生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，提高宿主生存率，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫。
　　2.HIFU輻照通過抑制腫瘤組織中miR-134對(duì)共刺激分子CD86的負(fù)調(diào)控作用，從而增強(qiáng)其抗腫瘤免疫。
　　3.HIFU輻照可以抑制脾組織中miR-181a對(duì)共刺激分子ICAM-1的負(fù)調(diào)控作用，這可能是HIFU輻照增強(qiáng)抗腫瘤免疫的機(jī)制之一。