局部微環(huán)境在小鼠黑色素瘤線形程序性壞死形成中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 觀察缺血缺氧和壓力等局部微環(huán)境變化對(duì)小鼠黑色素瘤線形程序性壞死(Linearly Patterned Programmed Cell Necrosis,LPPCN)的數(shù)量及分布規(guī)律的影響。分析不同局部微環(huán)境中黑色素移植瘤的生長(zhǎng)速度和方式,血管生成模式以及腫瘤侵襲能力的差別,初步闡明線形程序性壞死發(fā)生的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其作為血管生成擬態(tài)(Vasculogenic Mimicry,VM)形成的空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的重要意義,

2、豐富腫瘤血管生成相關(guān)理論。
　　 方法：
　　 1.動(dòng)物模型的建立
　　 缺血缺氧模型的建立:注射B16黑色素瘤細(xì)胞懸液到C57小鼠雙側(cè)后肢肌肉,通過(guò)結(jié)扎荷瘤的C57小鼠一側(cè)后肢股動(dòng)脈建立B16后肢缺血移植瘤模型。成瘤15d后處死小鼠,剖取移植瘤,福爾馬林溶液固定,石蠟包埋制作組織切片。生物力學(xué)模型的建立:注射B16瘤細(xì)胞懸液到C57小鼠后肢肌肉和腹腔內(nèi),成瘤9d后處死小鼠。每組小鼠分別剖取移植瘤,福爾馬林溶液固

3、定,石蠟包埋制作組織切片。
　　 2.分析LPPCN與VM形成的相關(guān)分子機(jī)制
　　 在石蠟切片上對(duì)比研究B16黑色素瘤在正常環(huán)境和缺血缺氧環(huán)境、高壓微環(huán)境和低壓微環(huán)境下腫瘤的生長(zhǎng)方式、LPPCN數(shù)目及其分布規(guī)律、VM數(shù)目以及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力等形態(tài)學(xué)和相關(guān)分子機(jī)制變化,揭示LPPCN形成的相關(guān)分子機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1.小鼠黑色素瘤中存在LPPON
　　 C57小鼠B16黑色素瘤中存在線形或網(wǎng)絡(luò)

4、狀排列的胞核深染、碎裂,胞漿濃縮、凝集,胞間接消失的LPPCN細(xì)胞。這些條帶狀結(jié)構(gòu)常常與周?chē)膬?nèi)皮依賴(lài)性血管相連通,有時(shí)可以見(jiàn)到由LPPCN條索圍成的管道,內(nèi)有紅細(xì)胞。并且不同LPPCN條帶與周?chē)鷥?nèi)皮依賴(lài)性血管之間的距離近乎相等。
　　 2.各組腫瘤組織LPPON數(shù)目的差別
　　 缺血模型中,缺血組的LPPCN計(jì)數(shù)(11.25±6.04)和LPPCN細(xì)胞計(jì)數(shù)(51.73±25.06)大于對(duì)照組(5.50±3.34；16.

5、50±4.01),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；生物力學(xué)模型中,LPPCN計(jì)數(shù)(13.80±6.05)和LPPCN細(xì)胞計(jì)數(shù)(56.46±28.36)大于腹腔組(6.67±3.12；16.98±8.69),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.LPPCN細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果
　　 散發(fā)性程序性壞死(Scattered Patterned Programmed Cell Necrosis,SPPCN,即LPPCN

6、形成的早期階段)細(xì)胞Bcl-2染色指數(shù)(3.68±1.37)大于LPPCN細(xì)胞Bcl-2染色指數(shù)(2.15±1.16)；SPPCN細(xì)胞Bax染色指數(shù)(2.10±0.79)小于LPPCN細(xì)胞Bax染色指數(shù)(4.35±1.20)。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組LPPCN細(xì)胞Caspase-3染色指數(shù)、Caspase-9染色指數(shù)及Bax染色指數(shù)均大于LPPCN周?chē)[瘤細(xì)胞,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.侵襲相

7、關(guān)蛋白的表達(dá)情況
　　 缺血組的HIF-1α染色指數(shù)(3.38±1.93)大于對(duì)照組HIF-1α染色指數(shù)(1.75±0.71)；后肢組的HIF-1α染色指數(shù)(3.10±1.60)大于腹腔組HIF-1α染色指數(shù)(1.89±0.60),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；缺血組MMP-2染色指數(shù)(3.00±0.76)、后肢組MMP-2染色指數(shù)(4.10±0.88)分別大于對(duì)照組MMP-2染色指數(shù)(1.38±0.52)和腹腔組MMP-2

8、染色指數(shù)(3.00±1.12),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；缺血組MMP-9染色指數(shù)(4.00±0.93)、后肢組MMP-9染色指數(shù)(4.40±0.70)分別大于對(duì)照組MMP-9染色指數(shù)(2.50±0.76)和腹腔組MMP-9染色指數(shù)(2.22±0.44),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MMP-2、MMP-9染色指數(shù)與LPPCN計(jì)數(shù)分別呈正相關(guān)(r=0.402,P=0.017；r=0.533,P=0.001)；缺血組Twist

9、1染色指數(shù)(3.25±0.89)、后肢組Twist1染色指數(shù)(4.00±0.94)分別大于對(duì)照組Twist1染色指數(shù)(1.88±0.84)和腹腔組Twist1染色指數(shù)(2.44±0.88),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 5.各組腫瘤組織VM計(jì)數(shù)的差別
　　 缺血組VM計(jì)數(shù)(6.13±0.99)大于對(duì)照組VM計(jì)數(shù)(2.13±1.13)；后肢組VM計(jì)數(shù)(9.40±4.48)大于腹腔組VM計(jì)數(shù)(3.44±1.01)

10、,差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 6.LPPON與VM之間的關(guān)系
　　 LPPCN計(jì)數(shù)、LPPCN細(xì)胞計(jì)數(shù)與VM數(shù)目分別呈正相關(guān)(r=0.551,P=0.001)；(r=0.613,P=0.000)。
　　 結(jié)論：
　　 1.腫瘤局部缺血缺氧和壓力變化可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生LPPCN；LPPCN可能是腫瘤細(xì)胞在局部缺血缺氧環(huán)境和高壓微環(huán)境下發(fā)生的不同于傳統(tǒng)凋亡和壞死的一種新的主動(dòng)性死亡方式,其死

11、亡途徑最終可能是經(jīng)由與線粒體凋亡途徑類(lèi)似的分子事件調(diào)控,但形態(tài)學(xué)上卻表現(xiàn)為壞死細(xì)胞的特征。
　　 2.腫瘤局部缺氧微環(huán)境和間質(zhì)液體壓力(Interstitial Fluid Pressure,IFP)對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力和VM形成有重要影響。在缺氧環(huán)境下以及腫瘤局部IFP增加時(shí),黑色素瘤細(xì)胞高表達(dá)HIF-1α,同時(shí)出現(xiàn)MMP-2、MMP-9以及Twist1的表達(dá)上調(diào),從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力,參與VM形成過(guò)程中的細(xì)胞外基質(zhì)重塑進(jìn)

12、而促進(jìn)VM的形成。
　　 3.在凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控下,部分腫瘤細(xì)胞可形成LPPCN,LPPCN的形成可能是VM和內(nèi)皮依賴(lài)性血管形成的空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　 LPPCN作為程序性壞死的一種特殊的死亡模式,其形成的機(jī)制及意義尚不完全明確。通過(guò)對(duì)其分子機(jī)制的研究,一方面可以豐富關(guān)于細(xì)胞死亡模式的理論,另一方面可能解釋在具有較高壓力的腫瘤組織內(nèi),其周?chē)M織內(nèi)的血管通過(guò)何種機(jī)制伸入到瘤組織內(nèi)并最終改善腫瘤的微循環(huán),從而進(jìn)一步為腫瘤血