間充質(zhì)干細(xì)胞分泌液對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞光老化的干預(yù)作用.pdf

1、目的:皮膚老化是由內(nèi)源性和外源性因素共同作用而引起的一種皮膚衰老現(xiàn)象。外源性皮膚衰老受多種外部因素的影響，包括接觸有毒物品、煙霧和各種射線等，其中，由紫外線輻射引起的皮膚老化，稱為光老化(Photoaging)。日光中的紫外線可以引起皮膚紅斑形成和延遲性黑色素的沉著，并且損壞皮膚的保濕能力，使皮膚變粗糙，皺紋增多。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)紫外線照射方法構(gòu)建體外皮膚細(xì)胞光老化模型。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛存在于骨髓、臍帶、臍帶血等，具有多向分化

2、能力，體外可誘導(dǎo)分化成多種細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞除了增殖分化作用外，還可以分泌大量細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可以參與組織的修復(fù)過(guò)程，包括抗凋亡細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、抗瘢痕細(xì)胞因子和多種抗氧化物質(zhì)等。骨髓來(lái)源干細(xì)胞(bonemarrow-derived mesenchymal stemcells，BMSCs)具有明顯應(yīng)用優(yōu)勢(shì):培養(yǎng)簡(jiǎn)單、快速生長(zhǎng)和良好的同源性。因此，應(yīng)用小鼠BMSCs分泌液，觀察其對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞光老化的預(yù)防和治療作用，

3、為干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　研究方法:1.細(xì)胞提取與鑒定:提取BALB/c小鼠皮膚成纖維細(xì)胞和BMSCs，應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)波形蛋白表達(dá)鑒定成纖維細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞流式方法檢測(cè)CD13、CD44、CD73、CD90、CD166、HLA-ABC、CD31、CD45、HLA-DR來(lái)鑒定BMSCs。2.BMSCs分泌液制備:無(wú)血清培養(yǎng)BMSCs48 h后收集其培養(yǎng)上清液，用于預(yù)防治療光老化成纖維細(xì)胞。3.實(shí)驗(yàn)組分組:對(duì)照組:含1

4、0％FBS的高糖DMEM培養(yǎng);老化組:含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)，然后進(jìn)行UVB/UVA聯(lián)合照射，UVB累計(jì)劑量37.5 mJ/cm2，UVA累計(jì)劑量262.2 mJ/cm2;預(yù)防組:先應(yīng)用BMSCs培養(yǎng)液培養(yǎng)成纖維細(xì)胞48 h，其余處理因素同光老化組;治療組:先按照光老化組處理因素處理細(xì)胞，然后用BMSCs培養(yǎng)液培養(yǎng)成纖維細(xì)胞48 h。4.指標(biāo)檢測(cè):細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;細(xì)胞衰老率;細(xì)胞上清中MDA、T-SOD、CAT、GSH-Px、N

5、O;用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2，細(xì)胞衰老基因p16、p21和再生基因p63的變化。
　　結(jié)果:1.細(xì)胞提取與鑒定:成纖維細(xì)胞用免疫熒光方法鑒定結(jié)果表達(dá)波形蛋白;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用細(xì)胞流式方法鑒定結(jié)果顯示CD13、CD44、CD73、CD90、CD166、HLA-ABC表達(dá)，而CD31、CD45、HLA-DR不表達(dá)。2.BMSCs分泌液對(duì)成纖維細(xì)胞相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)的影響:2.1通過(guò)對(duì)細(xì)胞光老化各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲

6、線的描繪:與對(duì)照組相比，老化組的細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)顯著偏低(P＜0.05);與老化組相比，預(yù)防組和治療組細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)明顯高于老化組(P＜0.05);預(yù)防組和治療組相比，生長(zhǎng)趨勢(shì)無(wú)明顯差異(P＞0.05);2.2β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，老化組細(xì)胞衰老染色率明顯增高(P＜0.05);與老化組相比，預(yù)防組和治療組細(xì)胞衰老的染色率明顯降低（P＜0.05）;預(yù)防組與治療組相比，細(xì)胞衰老染色率無(wú)明顯變化(P＞0.05);2.3 MDA、

7、T-SOD、CAT、GSH-Px、NO指標(biāo)檢測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比，老化組的細(xì)胞GSH-Px、CAT、T-SOD活性水平明顯下降(P＜0.05)，NO、MDA活性水平明顯升高(P＜0.05);與老化相比，預(yù)防組和治療組GSH-Px、CAT活性水平明顯高于老化組(P＜0.05)，MDA、NO活性水平明顯低于老化組(P＜0.05);但預(yù)防組和治療組之間，各項(xiàng)檢測(cè)數(shù)據(jù)之間無(wú)明顯差異(P＞0.05）;2.4應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)UVB不同照

8、射劑量的各組細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2，細(xì)胞衰老相關(guān)基因p16、p21和再生相關(guān)基因p63的變化，結(jié)果顯示:在總30 mJ照射劑量下，與對(duì)照組相比，老化組的bcl-2、p63基因表達(dá)水平升高(P＜0.001);與老化組相比:預(yù)防組的bax、bcl-2、p16、p21、p63基因表達(dá)水平均下降（P＜0.001），治療組的bcl-2、p63表達(dá)水平下降(P＜0.001)且bax、p16、p21表達(dá)水平升高(P＜0.05);與治療組相

9、比，預(yù)防組的bax、bcl-2、p16、p21、p63基因表達(dá)水平均下降(P＜0.05)。在總37.5 mJ照射劑量下，與對(duì)照組相比，老化組的bax、bcl-2、p16、p21基因表達(dá)水平升高(P＜0.001)且p63基因表達(dá)水平下降(P＜0.001);與老化組相比:治療組和預(yù)防組的bax、bcl-2、p16、p21基因表達(dá)水平均下降(P＜0.001)且p63基因表達(dá)水平升高(P＜0.001);與治療組相比，預(yù)防組的bax、bcl-2、

10、p63基因表達(dá)水平下降(P＜0.05)。在總45 mJ照射劑量下，與對(duì)照組相比，老化組的bax、bcl-2、p16、p21、p63基因表達(dá)水平均升高(P＜0.05);與老化組相比:預(yù)防組的bax、bcl-2、p16、p21、p63基因表達(dá)水平均下降(P＜0.05)，治療組的bax、bcl-2、p21、p63基因表達(dá)水平平下降（P＜0.05）且p16基因表達(dá)水平升高（P＜0.001）;與治療組相比，預(yù)防組的p16、p21表達(dá)水平下降(P＜