骨髓間充質干細胞和成纖維細胞的蛋白質組學研究.pdf

1、實驗背景：
　　骨髓間充質干細胞（Bone Marrow Stem Cells,BMSCs）作為目前較理想的組織工程瓣膜間質細胞的種子細胞，相對于其他來源的種子細胞具有獲取方便、很強的自我更新、多向分化潛能，以及獨特的免疫特性等優(yōu)點。正常心臟瓣膜間質細胞中的成纖維細胞對于維持正常心臟瓣膜的結構和功能具有更重要的意義。目前應用hBMSCs構建的組織工程心臟瓣膜多需移植入動物體內(nèi)后一段時間才能完成組織工程瓣膜的成纖維細胞表型和基質的最

2、后重塑，尚不清楚hBMSCs向成纖維細胞進行分化的具體機制以及其功能特點。
　　BMSCs和成纖維細胞具有非常相似細胞形態(tài)、細胞表型特點及細胞表面分子。通過基因組學的方法研究發(fā)現(xiàn)在兩種細胞中確實存在一些差異基因。蛋白質組，作為細胞基因組的最后表達，能夠更詳盡、更直接地描述細胞的結構和功能特點。
　　目的：
　　采用蛋白質組學的方法全面比較hBMSCs和成纖維細胞中蛋白表達的差異，進一步在蛋白水平理解兩種在細胞結構和功能

3、差異。
　　方法：
　　1．自正常人髂骨抽取骨髓，綜合采用密度梯度離心和貼壁篩選的方法，分離、純化出hBMSCs，在低糖DMEM/F12培養(yǎng)、擴增；倒置顯微鏡觀察細胞生長，流式細胞儀檢測表面抗原CD29、CD34和CD45，并對骨髓間充質干細胞進行成骨、成脂多向分化誘導，進行細胞性質鑒定。成纖維細胞是人成纖維細胞系細胞（購自Cell Applications公司）。
　　2．對兩種細胞的蛋白樣本進行雙向凝膠電泳分離，通

4、過銀染顯色，獲取兩種細胞的蛋白組學圖譜，通過比較兩種細胞的圖譜，挖取差異表達的蛋白點進行基質輔助激光解析電離飛行時間質譜肽質量指紋圖分析和蛋白數(shù)據(jù)庫信息檢索。選取蛋白進行Western Blot和免疫組織化學實驗驗證蛋白質組學的研究結果。
　　結果：
　　1．原代細胞呈貼壁,集落樣生長；細胞傳代后，呈梭形,少數(shù)細胞呈多角形，魚群或放射狀排列。hBMSCs的表面抗原CD29陽性而造血干細胞具有的表面抗原CD34和CD45為陰性

5、；成骨和成脂誘導后，分別行Von kossa染色和油紅-O染色結果呈陽性。實驗從正反兩方面論證、確認了所分離培養(yǎng)的細胞即為hBMSCs。
　　2．hBMSCs和成纖維細胞全蛋白提取后,進行雙向凝膠電泳分析,共進行3次實驗得到銀染結果，兩種細胞的電泳圖譜蛋白斑點分布模式具有一定的相似性。3次重復性實驗結果經(jīng)Imaging Master 2D Elite 510軟件分析,發(fā)現(xiàn)hBMSCs可以檢測到782±65個點,成纖維細胞可以檢測到

6、760±57個點,這些蛋白質等電點和相對分子質量分布范圍較廣,但大多數(shù)集中于pH4～8,相對分子質量15～100ku區(qū)域。對其中穩(wěn)定表達的差異蛋白質斑點進行切割,用胰蛋白酶消化后進行基質輔助激光解析電離飛行時間質譜分析，通過UniProtKB/Swiss-PROT和NCBI nonredundant protein databases蛋白數(shù)據(jù)庫搜索，成功地鑒定出29種表達蛋白，其中有17種蛋白在兩種細胞中有顯著差別地表達，另外12種蛋白