CRISPR-Cas9介導(dǎo)hFAD3基因在牛NCAPG-LCORL位點(diǎn)定點(diǎn)整合研究.pdf

1、本研究利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)，將無(wú)抗性無(wú)標(biāo)記基因的hFAD3基因表達(dá)盒定點(diǎn)敲入牛NCAPG-LCORL位點(diǎn)，研究hFAD3基因的表達(dá)對(duì)脂肪酸含量，位點(diǎn)旁側(cè)基因以及脂肪酸相關(guān)基因表達(dá)的影響，獲得定點(diǎn)整合陽(yáng)性單克隆細(xì)胞的效率，同時(shí)比較有無(wú)MAR序列介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中hFAD3基因的表達(dá)量，結(jié)果如下:
　　1.針對(duì)牛NCAPG-LCORL位點(diǎn)成功構(gòu)建了Cas9切割載體:pCas Guide-B。利用人工合成人源化hFAD3基因，成

2、功構(gòu)建了5種hFAD3基因定點(diǎn)整合載體:C2(5'arm-CAG-hFAD3-PolyA-3'arm)、M2(5'arm-MAR-CAG-hFAD3-PolyA-MAR-3'arm)、P2(pGT-C1-LHA-RHA-hFAD3)、C22(LHA-CAG-hFAD3-PolyA-3'arm)和CRL(LHA-CAG-hFAD3-PolyA-RHA)。
　　2.對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞DNA、RNA、脂肪酸水平進(jìn)行分析。1）PCR鑒定及測(cè)序結(jié)

3、果表明，實(shí)現(xiàn)了多種hFAD3基因定點(diǎn)整合載體在牛NCAPG-LCORL位點(diǎn)的定點(diǎn)整合。2）外源基因hFAD3在RNA水平正常表達(dá)。3）Real-time quantitativePCR結(jié)果表明hFAD3基因整合后，使得位點(diǎn)上游NCAPG基因表達(dá)量上調(diào)，下游LCORL基因表達(dá)量下調(diào)。4）運(yùn)用氣相質(zhì)譜儀對(duì)轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及其培養(yǎng)液的脂肪酸含量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，hFAD3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中ω6/ω3 PUFAs比值(0.565)較非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞

4、(1.549)顯著下降(P＜0.01);轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)液中ω6/ω3 PUFAs比值(0.623)較非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)液(0.848)顯著下降(P＜0.05)。5) Real-time quantitative PCR結(jié)果表明，hFAD3基因表達(dá)后，脂肪酸分解相關(guān)基因(PPARg、LIFE、LPL)表達(dá)量總上調(diào)倍數(shù)大于脂肪酸合成相關(guān)基因(ACC、SCD、FASN)，說(shuō)明hFAD3基因的表達(dá)使得細(xì)胞內(nèi)的脂肪趨于分解。
　　3.通過(guò)流式

5、分選以及無(wú)限稀釋法篩選陽(yáng)性單克隆細(xì)胞。gB+C2實(shí)驗(yàn)組共獲得59株單克隆細(xì)胞，經(jīng)PCR及測(cè)序鑒定，其中定點(diǎn)整合陽(yáng)性單克隆細(xì)胞3株，定點(diǎn)整合效率為5.1％。同時(shí)檢測(cè)單克隆細(xì)胞株脂肪酸的含量與位點(diǎn)旁側(cè)基因和脂肪相關(guān)基因的表達(dá)量，結(jié)果與轉(zhuǎn)染后細(xì)胞一致。
　　4.比較有無(wú)MAR序列介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中hFAD3基因的表達(dá)量，MAR介導(dǎo)組是無(wú)MAR介導(dǎo)組的5.91倍(p＜0.01)。
　　綜上所述，利用CRISPR/Cas9技術(shù)可實(shí)現(xiàn)h