31589.轉(zhuǎn)過表達(dá)和低表達(dá)胰島素樣生長因子ⅰ基因牛成纖維細(xì)胞系的制備

1、內(nèi)蒙古大學(xué)碩士學(xué)位論文轉(zhuǎn)過表達(dá)和低表達(dá)胰島素樣生長因子Ⅰ基因牛成纖維細(xì)胞系的制備姓名：楊美玲申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：動物學(xué)指導(dǎo)教師：倉明20090601內(nèi)蒙古大學(xué)壩士學(xué)位論文通過組織塊貼附法成功分離出牛胎兒成纖維細(xì)胞，利用DMEM10％FBS培養(yǎng)液在37。C、5％C02、飽和濕度條件下體外培養(yǎng)和傳代，各代成纖維細(xì)胞在DMEM20％FBs1O％DMSO培養(yǎng)液中冷凍保存；同時(shí)詳細(xì)記錄牛胎兒成纖維細(xì)胞的形態(tài)和生長特性，繪制了第5和10代牛胎兒

2、成纖維細(xì)胞的生長曲線，并制作和分析了第5代細(xì)胞中期染色體的數(shù)目。通過以上分析證明，分離和培養(yǎng)的牛胎兒成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境下，隨代次增加，生長速度漸緩；第五代染色體數(shù)目正常(2n=60)，可以用第五代前的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。同時(shí)檢測了牛胎兒成纖維細(xì)胞對篩選藥物G418和潮霉素的耐受性，濃度稀釋梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定G418的最佳篩選濃度為800pg／ml，潮霉素最佳篩選濃度為50pg／ml。3牛胎兒成纖維細(xì)胞的外源基因轉(zhuǎn)染以及轉(zhuǎn)基因克隆細(xì)胞的

3、篩選和鑒定用脂質(zhì)體法和電擊法轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞，48小時(shí)后分析轉(zhuǎn)染效果并進(jìn)行篩選。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測了轉(zhuǎn)染48小時(shí)后載體的表達(dá)效率，與對照組細(xì)胞相比發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體plRES2EGFPIGFl的細(xì)胞中IGF—I表達(dá)量顯著升高，約是對照組的40倍(PO05)，轉(zhuǎn)染干擾載體pGCsiIGFl的細(xì)胞中IGF—I表達(dá)量則顯著降低，約是對照組的0023倍(Po05)，表明構(gòu)建的2個(gè)載體具有正常的功能，可以進(jìn)行下一步的篩選。轉(zhuǎn)染48小

4、時(shí)后以800刪G418和50Itg／ml潮霉素為抗性篩選濃度，在DMEM10％FBS培養(yǎng)液在37℃、5％C02、飽和濕度條件下連續(xù)培養(yǎng)1012天，分別獲得了表達(dá)綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因克隆細(xì)胞。通過對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞基因組DNA的PCR擴(kuò)增，證實(shí)外源基因已穩(wěn)定整合在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞基因組中，可以用做核移植的核供體細(xì)胞，制備轉(zhuǎn)基因胚胎模型，為進(jìn)一步研究IGFI在體外牛胚胎發(fā)育過程中的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：胰島素樣生長因子I，過表達(dá)載體，干