31589.轉過表達和低表達胰島素樣生長因子ⅰ基因牛成纖維細胞系的制備

1、內蒙古大學碩士學位論文轉過表達和低表達胰島素樣生長因子Ⅰ基因牛成纖維細胞系的制備姓名：楊美玲申請學位級別：碩士專業(yè)：動物學指導教師：倉明20090601內蒙古大學壩士學位論文通過組織塊貼附法成功分離出牛胎兒成纖維細胞，利用DMEM10％FBS培養(yǎng)液在37。C、5％C02、飽和濕度條件下體外培養(yǎng)和傳代，各代成纖維細胞在DMEM20％FBs1O％DMSO培養(yǎng)液中冷凍保存；同時詳細記錄牛胎兒成纖維細胞的形態(tài)和生長特性，繪制了第5和10代牛胎兒

2、成纖維細胞的生長曲線，并制作和分析了第5代細胞中期染色體的數(shù)目。通過以上分析證明，分離和培養(yǎng)的牛胎兒成纖維細胞在體外培養(yǎng)環(huán)境下，隨代次增加，生長速度漸緩；第五代染色體數(shù)目正常(2n=60)，可以用第五代前的細胞進行轉染實驗。同時檢測了牛胎兒成纖維細胞對篩選藥物G418和潮霉素的耐受性，濃度稀釋梯度實驗結果確定G418的最佳篩選濃度為800pg／ml，潮霉素最佳篩選濃度為50pg／ml。3牛胎兒成纖維細胞的外源基因轉染以及轉基因克隆細胞的

3、篩選和鑒定用脂質體法和電擊法轉染牛胎兒成纖維細胞，48小時后分析轉染效果并進行篩選。利用實時定量PCR技術檢測了轉染48小時后載體的表達效率，與對照組細胞相比發(fā)現(xiàn)，轉染過表達載體plRES2EGFPIGFl的細胞中IGF—I表達量顯著升高，約是對照組的40倍(PO05)，轉染干擾載體pGCsiIGFl的細胞中IGF—I表達量則顯著降低，約是對照組的0023倍(Po05)，表明構建的2個載體具有正常的功能，可以進行下一步的篩選。轉染48小

4、時后以800刪G418和50Itg／ml潮霉素為抗性篩選濃度，在DMEM10％FBS培養(yǎng)液在37℃、5％C02、飽和濕度條件下連續(xù)培養(yǎng)1012天，分別獲得了表達綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的轉基因克隆細胞。通過對轉基因細胞基因組DNA的PCR擴增，證實外源基因已穩(wěn)定整合在轉基因細胞基因組中，可以用做核移植的核供體細胞，制備轉基因胚胎模型，為進一步研究IGFI在體外牛胚胎發(fā)育過程中的機理奠定了基礎。關鍵詞：胰島素樣生長因子I，過表達載體，干