CRISPR-Cas9技術(shù)在氟喹諾酮C-7位取代基作用機制探究中的應(yīng)用.pdf

1、近年來，由于氟喹諾酮類藥物的大量使用，導(dǎo)致越來越多的耐藥突變菌被發(fā)現(xiàn)，這使得研究細菌耐藥性產(chǎn)生機制、開發(fā)更優(yōu)良的殺菌劑成為了整個醫(yī)療界的重要任務(wù)。目前，氟喹諾酮類藥物性能的提升主要通過修飾母核C上的取代基來實現(xiàn)，其中C-7位取代基可變性強，在新藥開發(fā)中有著較好的運用前景，因此研究C-7位取代基在氟喹諾酮殺菌過程中的作用機制有著重要意義。另外，據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)，氟喹諾酮C-7環(huán)末端恰好落在gyrB466處，但由于還未獲得466位單突變體，所

2、以目前還沒能真正揭示兩者之間的作用關(guān)系和強度。
　　CRISPR/Cas9是一項高效準(zhǔn)確的新興基因編輯技術(shù)，其在基因功能的研究中具有重要作用。本論文通過使用 CRISPR/Cas9技術(shù)和λ-red同源重組技術(shù)構(gòu)建了gyrB466C突變體，并對突變體進行了藥敏性檢測，以分析 gyrB466位氨基酸與氟喹諾酮類藥物的作用情況，實驗主要的內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　通過構(gòu)建CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)和λ-red同源重組系統(tǒng)，成功

3、的將編碼大腸桿菌MG1655 gyrB466位氨基酸的堿基GAA替換為了TGT，其中，替換效率達到了100％。后對獲得的gyrB466單突變體進行了環(huán)丙沙星藥敏實驗，實驗結(jié)果表明：突變型菌株的最小抑菌濃度（MIC）是野生型菌株的4倍，藥物動力學(xué)實驗表明，其絕對致死濃度（LD100）為0.2μg/ml，為野生型菌株的4倍，且同濃度環(huán)丙沙星對突變型菌株的殺菌效率明顯降低。實驗結(jié)果表明：gyrB466位氨基酸與環(huán)丙沙星具有相互作用，其突變會降