重組AcNPV載體系統(tǒng)在家蠶基因功能定量研究中的應(yīng)用.pdf

1、重組AcNPV載體系統(tǒng)是中科院上海生化、細(xì)胞所陸長德實(shí)驗(yàn)室近年來發(fā)展出來用于家蠶基因功能研究的載體，為了進(jìn)一步發(fā)揮此載體系統(tǒng)在家蠶基因功能研究中的作用，本工作的目的是建立利用此系統(tǒng)在家蠶中進(jìn)行基因功能的定量研究的方法。 將A3啟動(dòng)子攜帶的熒光素酶基因的表達(dá)框重組到bacmidAc△EGT基因組中，構(gòu)建了重組病毒AcNPVA3Luc(在此Ac表示的是Autographacalifomica，NPV表示的是nucleopolyhed

2、rovirus，A3Luc表示的是由A3啟動(dòng)子攜帶的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)框)。重組病毒經(jīng)血被注射進(jìn)五齡起家蠶。病毒感染過程顯示重組AcNPV(rAcNPV)的基因拷貝數(shù)在血淋巴細(xì)胞中增加最快，然后依次是脂肪體、馬氏管、中腸及絲腺。在不敏感品系的家蠶中，我們發(fā)現(xiàn)rAcNPV在侵入所有被測(cè)組織中的能力并沒有明顯差別。病毒感染的差別主要體現(xiàn)了rAcNPV在家蠶不同組織中很大的復(fù)制差別。實(shí)時(shí)定量RT-PCR表明了病毒DNA復(fù)制的不同歸功于

3、不同的基因表達(dá)。 在定量確定了重組病毒感染敏感家蠶幼蟲各組織的時(shí)序性后，我們將家蠶A3啟動(dòng)子(671bp)攜帶的熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)框和家蠶核多角體病毒IE-1啟動(dòng)子(580bp)攜帶的熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)框分別轉(zhuǎn)入bacnudAc△EGT得到重組苜蓿銀紋夜蛾多角體病毒AcNPVA3Luc和AcNPVIELuc。重組桿狀病毒被注入五齡起家蠶幼蟲血液中。我們使用熒光素酶活性測(cè)定檢測(cè)了A3和IE-1啟動(dòng)子在家蠶各組織中的活性，并

4、用重組病毒的拷貝數(shù)進(jìn)行了歸一化。結(jié)果顯示A3啟動(dòng)子的活性比IE-1啟動(dòng)子活性高近10倍；A3啟動(dòng)子和IE-1啟動(dòng)子的活性都是在絲腺中最高，然后依次是脂肪體、中腸、馬氏管和血淋巴細(xì)胞。在絲腺中，兩個(gè)啟動(dòng)子的活性都是在后部絲腺中最高，然后是中部絲腺和前部絲腺。兩個(gè)啟動(dòng)子活性的差別，反映了在家蠶幼蟲組織的不同生長速度。在rAcNPV注射后至少3～4天內(nèi)，A3啟動(dòng)子的活性維持不變，而且，其活性不受病毒因子影響。 鑒于用EGFP的定性方法

5、在研究啟動(dòng)子活性上的局限性，我們建立了一套定量檢測(cè)啟動(dòng)子活性的系統(tǒng)，即雙熒光定量檢測(cè)手段，并將其引入重組AcNPV載體系統(tǒng)。選擇以螢火蟲熒光素酶(FireflyLuciferase，F(xiàn)Luc)為報(bào)告基因，以水母熒光素酶(RenillaLuciferase，RLuc)為內(nèi)參報(bào)告基因，檢測(cè)報(bào)告基因的強(qiáng)度，同時(shí)通過內(nèi)參報(bào)告基因校正調(diào)整。本工作中測(cè)定的熒光素酶和作為內(nèi)參的熒光素酶是裝在同一個(gè)病毒中的，這樣就確保了二者的拷貝數(shù)的完全相同。利用此定