BmGem1和BmGem2在家蠶細胞中的功能鑒定.pdf

1、細胞周期活動是一個普遍而又非常復雜的級聯(lián)調控過程，它與細胞的增殖和分化、DNA的損傷和修復以及個體的發(fā)育、器官的形成、壞死組織的再生和疾病的發(fā)生密切相關。多細胞生物的正常發(fā)育依賴于細胞增殖及分化的一系列嚴密調控過程，研究表明多種蛋白在這一過程中起著非常重要的作用。Geminin蛋白就是其中一種，它是1998年首先在爪蟾卵的抽提物中被鑒定到的一個不穩(wěn)定小分子核蛋白。Geminin包含一段特殊的coiled-coil超螺旋二級結構，通過競爭

2、性結合DNA復制起始因子Cdt1或多種參與細胞分化的轉錄調控因子，調控個體發(fā)育過程中細胞的增殖和分化。目前，Geminin作為偶聯(lián)細胞增殖與分化的一個關鍵的周期調控因子已經(jīng)成為研究熱點。本研究在本實驗室已克隆并鑒定的兩個家蠶Geminin基因，BmGem1和BmGem2以及復制起始因子BmCdt1的基礎上，利用免疫共沉淀、雙分子熒光互補技術、基因干擾和過表達技術以及酵母雙雜交技術等多種分子細胞生物學研究方法對其在細胞中的功能展開深入的研

3、究，這將為家蠶細胞周期調控的研究奠定基礎，并且能夠豐富細胞生物學相關理論。獲得的主要研究結果如下:
　　1.BmGem1、BmGem2與BmCdt1之間的相互作用關系
　　本研究通過雙分子熒光互補技術(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)的方法對BmGem1、BmGem2以及BmCdt1蛋白之間的相互作用關系進行檢測。在家蠶卵巢細胞系BmN-SWU1中BiFC和Co-IP結果表明:BmGem1和BmGem2在細胞核中自身都能

4、相互作用，并且BmGem1和BmGem2之間也存在相互作用;在細胞核中BmGem1能與BmCdt1發(fā)生相互作用，而BmGem2不能與BmCdt1發(fā)生相互作用，但是BmGem2能在細胞質中與BmCdt1發(fā)生相互作用。另外，Co-IP檢測結果顯示:當BmGem1、BmGem2和BmCdt1在家蠶BmN-SWU1細胞中共同轉染時，在細胞質中BmGem1與BmGem2都能與BmCdt1發(fā)生相互作用，不存在相互競爭結合的關系，在細胞核中BmGem

5、1與BmCdt1能發(fā)生相互作用，而BmGem2不能與BmCdt1相互作用。這些研究結果表明，BmGem1是家蠶細胞直接與BmCdt1相互作用的 Geminin蛋白直系同源物，而BmGem2在細胞周期調控中的作用以及執(zhí)行的功能的分子機制可能與Geminin蛋白存在差異。
　　2.BmGem1和BmGem2干涉對家蠶細胞的影響
　　利用基于家蠶miRNA-based的RNAi載體在家蠶卵巢細胞系BmN4細胞中對BmGem1和Bm

6、Gem2表達進行敲降。qRT-PCR檢測結果表明BmN4細胞中轉染BmGem1RNAi載體后，在對照組(conlRNAi)BmGem1和BmGem2基因表達量為1的基礎上， BmGem1的mRNA水平下降為0.39±0.01，BmGem2的mRNA水平則升高為1.28±0.01;而轉染BmGem2 RNAi后在對照組(con2RNAi) BmGem2和BmGem1基因表達量為1的基礎上，qRT-PCR檢測結果表明BmGem2的mRNA水

7、平下降為0.61±0.07，BmGem1的mRNA水平則升高為1.66±0.04，同時干涉BmGem1和BmGem2后在對照組(conRNAi) BmGem1和BmGem2基因表達量為1的基礎上，qRT-PCR檢測結果表明BmGem1的mRNA水平下降為0.78±0.05，BmGem2的mRNA水平下降為0.68±0.06，這些研究結果表明兩者之間存在一定的劑量補償?shù)年P系，暗示兩個蛋白雖然與BmCdt1作用機制存在差異，但在家蠶細胞中的

8、功能仍然存在一定關聯(lián)。
　　BmN4細胞中BmGem1干涉后細胞體積明顯的增大，統(tǒng)計分析結果表明BmGem1干涉組中有58.35％左右的細胞體積增大，對照組中僅有5.24％左右的細胞體積增大的細胞;BmGem2干涉組中未發(fā)現(xiàn)有明顯的細胞體積增大的現(xiàn)象;但是同時干涉BmGem1和BmGem2后細胞體積增大的現(xiàn)象更為顯著，達到被干涉細胞的87.35％左右，顯著高于BmGem1單獨干涉組。細胞增殖活性檢測結果顯示BmGem1干涉的家蠶細

9、胞中細胞增殖活性下降了36％左右，而BmGem2干涉的BmN4細胞中細胞增殖活性沒有明顯的變化;Bm Gem1和BmGem2共同干涉后細胞的增殖活性下降了53％左右，與BmGem1單獨干涉組相比增殖活性顯著下降。另外，流式細胞檢測結果表明，BmGem1干涉后誘發(fā)DNA重復復制現(xiàn)象，而BmGem2干涉則不能誘發(fā)這種現(xiàn)象。并且與單獨干涉BmGem1相比，BmGem1和BmGem2共同干涉后誘發(fā)家蠶細胞DNA重復復制現(xiàn)象更顯著。說明BmGem

10、1蛋白在家蠶細胞中能與BmCdt1蛋白直接相互作用調控細胞中DNA復制的起始，細胞缺失BmGem1表達誘發(fā)DNA重復復制的發(fā)生，致使細胞核體積變大;BmGem2不能與BmCdt1直接相互作用，其缺失表達并不會導致細胞周期進程中DNA重復復制;而兩者同時缺失時抑制細胞增殖和誘發(fā)DNA重復復制能力增強，暗示BmGem2仍然參與調控細胞周期的相關過程，但BmGem2在細胞周期調控中的作用能夠被BmGem1替代。
　　3.BmGem1和B

11、mGem2過表達對家蠶細胞的影響
　　在BmN4細胞中分別過表達BmGem1和BmGem2基因后，熒光顯微鏡下觀察單個細胞形態(tài)無明顯的變化;但是BmGem1過表達組與對照相比細胞密度明顯下降，細胞增殖活性檢測結果表明細胞增殖活性下降了40％左右;而BmGem2過表達后對細胞增殖活性沒有明顯的變化;細胞流式結果表明，BmGem1過表達后G1期的細胞數(shù)目沒有明顯的變化，S期的細胞數(shù)目顯著增加，G2/M期的細胞數(shù)目則顯著降低;而BmGe

12、m2過表達后各個時期的細胞數(shù)目都沒有明顯的變化。這表明BmGem1過表達使細胞周期阻滯在S期，而不能進入G2/M期，過表達BmGem2對細胞周期沒有明顯的影響。
　　BmN4細胞轉染BmGem1和BmGem2過表達載體后利用Brdu標記DNA復制起始情況，免疫熒光檢測結果顯示過表達BmGem1的細胞中具有DNA復制活性的細胞為0.16±0.09，對照組細胞為0.51±0.07，BmGem1過表達細胞的DNA合成活性顯著降低;而過表

13、達BmGem2的DNA合成活性沒有顯著差異。過表達研究結果表明，BmGem1在家蠶細胞周期進程中起著關鍵作用，BmGem1過表達阻滯細胞周期進行并抑制細胞增殖;而BmGem2在細胞周期調控中的作用較弱，它的過表達對細胞周期進行及細胞增殖無顯著影響。
　　4.BmGem2相互作用蛋白的篩選及鑒定
　　我們的前期研究結果顯示，BmGem2在DNA復制起始及細胞周期調控中的作用與BmGem1蛋白存在顯著差異，為了精確分析BmGem

14、2在家蠶細胞中執(zhí)行的相關功能，我們通過酵母雙雜交技術鑒定家蠶中與BmGem2相互作用的蛋白。利用胚胎期、5齡第3天、游走期以及化蛹期的整蠶的總RNA構建家蠶酵母雙雜交文庫。并以BmGem2為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交技術共篩選獲得能夠與BmGem2發(fā)生相互作用的陽性克隆34個，分別編碼23個基因，剔除這23個基因中因重組cDNA造成的移碼錯義的基因，最終我們獲得陽性克隆數(shù)是12個，隨后我們對這12個基因進行克隆鑒定。通過雙重免疫熒光檢測和

15、免疫共沉淀方法，最終鑒定到4個基因（17號，21號，38號，39號）分別能夠與BmGem2共定位且產(chǎn)生相互作用。
　　生物信息學分析結果顯示，17號和39號基因編碼的蛋白是家蠶中特異的蛋白，序列分析結果顯示在其它物種中未鑒定到其同源物。而21號基因編碼的蛋白是果蠅中Centrosomin蛋白的同源物，因此將21號基因命名為Bmcnn，研究表明Centrosomin參與細胞骨架調控并對于染色體結構穩(wěn)定起著很重要作用，qRT-PCR檢

16、測結果顯示Bmcnn在家蠶5齡第3天正在進行高強度有絲分裂的精巢和卵巢中高表達，而在核內(nèi)有絲分裂旺盛的絲腺中幾乎不表達，推測BmGem2可能與細胞染色體結構的調控有關。39號基因編碼的蛋白是哺乳動物核糖體生物合成調控蛋白RRS1的同源物，將39號基因命名為BmRRS1，qRT-PCR檢測結果顯示BmRRS1在家蠶5齡第3天的各個組織都有表達，且在精巢、卵巢和絲腺中表達量較高，推測BmGem2可能與核糖體生物合成調控有關。這些研究結果表明