家蠶短散在重復元件BmSer_SINE的鑒定和功能研究.pdf

1、家蠶作為一種能吐絲結(jié)繭的重要的經(jīng)濟昆蟲，是由野桑蠶馴化而來的。絲腺是家蠶泌絲器官，家蠶發(fā)育到五齡以后開始大量合成絲蛋白形成繭殼，總計合成大約0.5g。家蠶轉(zhuǎn)基因技術建立以后，如何利用絲腺作為生物反應器高效的合成外源蛋白成為研究者研究的焦點。蠶絲主要成分是絲素和絲膠，利用轉(zhuǎn)基因技術與輕鏈絲素融合表達的外源蛋白需要高鹽高變性劑才能純化，其原因是絲素蛋白不溶于水。但同為繭絲蛋白的絲膠卻是溶于水的，絲膠蛋白在清水中溶解特性表明絲膠1蛋白最先溶解

2、出來，也是含量最多的蛋白。本研究在于克隆家蠶絲膠l基因啟動子，利用轉(zhuǎn)基因技術在中部絲腺特異表達可以分泌到繭殼中的外源蛋白。在克隆絲膠1基因啟動子時，利用大造品系基因組克隆絲膠1基因啟動子，得到的產(chǎn)物大小與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄序列一致，而利用N4品種基因組克隆得到的產(chǎn)物大小要比GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄序列小449個堿基。調(diào)查發(fā)現(xiàn)在許多家蠶品種絲膠1基因啟動子中存在序列的插入(缺失)現(xiàn)象，將449bp插入序列與家蠶全基因組序列和Ge

3、nBank數(shù)據(jù)庫中序列做BLASTN比對分析表明，它可能是短散在重復元件(SINE)。對這一短散在元件的起源、插入位點、功能、功能的作用機理等方面進行了研究。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 ⑴根據(jù)日本學者Matsunami在GenBank中提交的絲膠1基因上游調(diào)控序列(AB007831.1)設計引物擴增家蠶絲膠1基因啟動子，選取家蠶、野桑蠶共78個品系對絲膠1基因啟動子作了調(diào)查。擴增結(jié)果表明絲膠1啟動子片段大小之間存在差異：7個

4、品種的基因組DNA擴增出與預期大小一致的條帶(1kb)；46個品種擴增結(jié)果比預期條帶小，為660bp；9個品種同時擴增出1kb和660bp大小的兩條帶。利用CLUSTAL．X1.83對克隆的各個品種的絲膠1基因啟動子序列分析表明：①不同品種絲膠1基因啟動子660bp的片段序列相似性都較高，存在兩處由GCTA和Poly(A)引起的插入突變；(2)克隆不同品種的絲膠1基因啟動子1kb片段序列的相似性也很高，也同樣存在一處Poly(A)的插入

5、突變；(3)將1kb和660bp序列兩者之間比對后表明，前者的絲膠1基因啟動子中插入了449bp的堿基序列；④兩種類型絲膠1基因啟動子序列的共同的特點是都存在SA、SB和SC的順式作用元件；⑤擴增出的絲膠1基因啟動子長度與家蠶品種的生態(tài)類型、地理系統(tǒng)來源和化性之間未發(fā)現(xiàn)相關性和某種規(guī)律性，在家蠶和野桑蠶之間也未見規(guī)律性。
　　 ⑵利用家蠶全基因組數(shù)據(jù)對絲膠1基因啟動子中449bp的插入序列分析表明，它在家蠶基因組中的拷貝數(shù)為47

6、70個，且均勻的分布在家蠶染色體上，它在家蠶基因組中整合位點為富含TA區(qū)域，與家蠶反轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果表明它可能起源于BILINE。根據(jù)它在基因組中的分布、插入位點、起源，推測它可能是短散在重復序列(SINE)，并命名為BmSer_SINE。利用PCR和southern雜交技術確認它存在于所有品種的家蠶基因組中。
　　 ⑶將缺失或者刪除的絲膠1基因啟動子片段和BmSer_SINE片段克隆到pGL3_basic載體，重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)

7、染草地貪夜蛾卵巢細胞(Sf9)和家蠶胚胎細胞(BmE)。利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)間接檢測缺失或者刪除的絲膠1基因啟動子和BmSer_SINE序列活性。結(jié)果表明BmSer_SINE作為啟動子的螢火蟲熒光素酶在(Sf9)和(BmE)中都有相對活性，而缺失或者刪除的絲膠1基因啟動子片段，僅在含完整BmSer SINE序列時，在BmE中有微弱的啟動活性，而無論何種序列在Sf9細胞中均無啟動子活性。結(jié)果表明，完整的BmSer_SINE序列可能具有啟

8、動子活性。
　　 ⑷將缺失或者刪除的絲膠1基因啟動子和紅色熒光(DsRed)、腺病毒SV40的終止序列構(gòu)建成表達盒，再將表達盒克隆到pBac[3XP3—EGFP]載體形成pBac[3XP3—EGFP，Ser—DsRed]重組質(zhì)粒。利用轉(zhuǎn)基因技術分別將各種絲膠1基因啟動子序列片段驅(qū)動的DsRed表達盒整合到家蠶基因組中形成家蠶轉(zhuǎn)基因系。利用定量PCR檢測DsRed的轉(zhuǎn)錄水平，檢測缺失或者刪除的絲膠1基因啟動子活性，結(jié)果表明，絲膠1

9、基因啟動子中的BmSer_SINE序列具有增強子的活性，利用Western blot檢測絲膠中DsRed的表達量，結(jié)果表明BmSer SINE具有增強蛋白質(zhì)翻譯的功能。此外，將轉(zhuǎn)基因系的整個絲腺、脂肪體在熒光顯微鏡下檢測，DsRed僅在中部絲腺表達。結(jié)果表明：①BmSer_SINE對絲膠1基因啟動子的組織特異性表達沒有調(diào)控作用；②決定絲膠1蛋白組織特異性表達的調(diào)控元件在絲膠1基因啟動子的—148～—1區(qū)域。
　　 ⑸經(jīng)http：

10、//www．cbil．upenn．edu/cgi—bin/tess/tess?RQ=WELCOME預測BmSer_SINE序列中含有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，凝膠遷移實驗驗證BmSer_SINE中存在的順式元件能與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，Cy3標記的片段與轉(zhuǎn)錄因子形成的復合物經(jīng)LC/MS/MS鑒定為真核生物翻譯起始因子、延伸因子、ATPase、GTP結(jié)合蛋白及核糖核蛋白等核因子。
　　 ⑹將BmSer_SINE與GenBank數(shù)據(jù)庫和家蠶EST