BmNPV侵染家蠶中腸組織轉(zhuǎn)錄組分析及BmTret1-like基因的功能鑒定.pdf

1、由家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori. Nucleopolyhedrovirus, BmNPV）引起的血液型膿病是一種急性傳染病，一旦感染，就會(huì)給養(yǎng)蠶業(yè)造成巨大損失。培育抗性品種和篩選抗性基因是蠶業(yè)研究工作者不斷探討的課題。本實(shí)驗(yàn)以研究室育成的對(duì)BmNPV有高抗性的家蠶品種和常規(guī)品種為素材，對(duì)感染病毒后家蠶抗性品種和常規(guī)品種中中腸組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得可能參與家蠶抗病毒機(jī)制中的差異基因。以篩選出的家蠶促海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子樣（

2、Bombyx mori facilitated trehalose transporter Tret1-like，BmTret1-like）基因?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)其進(jìn)行基因克隆及基因表達(dá)分析，通過(guò)RNAi技術(shù)初步探討B(tài)mTret1-like基因與家蠶抗病毒的關(guān)系。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1、BmNPV侵染家蠶中腸組織轉(zhuǎn)錄組分析
　　我們以家蠶抗性品種BYN和常規(guī)品種BY中腸組織為材料構(gòu)建文庫(kù)，共得到12.82Gb C

3、lean Date（BY品種得到6.40Gb Clean Date，BYN品種得到6.42Gb Clean Date），樣品Q30堿基百分比均不小于86.03％。將Clean Date與參考基因組序列比對(duì)，可得到序列在參考基因組中的位置信息及樣品特有的序列信息。在識(shí)別單堿基錯(cuò)配，查找潛在單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)時(shí)樣品BY比對(duì)出57789個(gè)SNP位點(diǎn)，BYN比對(duì)出58725個(gè)SNP位點(diǎn)，2個(gè)文庫(kù)中SNP位點(diǎn)分布在基因區(qū)的比例達(dá)到60%以上。將M

4、apped Reads拼接后與原基因組注釋信息比較，共發(fā)掘出788個(gè)新基因。
　　在BmNPV侵染家蠶后蠶體內(nèi)參與抗病機(jī)理調(diào)節(jié)的基因較多。在篩選到的496個(gè)差異表達(dá)基因中，244個(gè)基因發(fā)生上調(diào)，252個(gè)基因發(fā)生下調(diào)，其中有486個(gè)基因被注釋。對(duì)unigenes進(jìn)行GO分類分析可知屬細(xì)胞組件中細(xì)胞和細(xì)胞膜占主要部分；屬生物進(jìn)程中代謝過(guò)程、單組織進(jìn)程、細(xì)胞進(jìn)程和生物調(diào)節(jié)所包含的基因較多；屬分子功能中具有催化活性和結(jié)合功能的基因數(shù)目較多

5、。KEGG信號(hào)通路分析可知有142個(gè)基因被注釋。在COG數(shù)據(jù)庫(kù)分析中發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要與氨基酸、碳水化合物、無(wú)機(jī)離子的代謝與運(yùn)輸有關(guān)。
　　家蠶感染BmNPV病毒后體內(nèi)出現(xiàn)復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控，有多條通路參與抗病毒機(jī)制的調(diào)節(jié)。在與參考基因比對(duì)中有大部分基因被定位在單一通路上，這些基因的特征及其抗病機(jī)理的影響需要進(jìn)一步研究。
　　2、家蠶BmTret1-like基因的克隆及表達(dá)分析
　　通過(guò)家蠶抗性品種BYN和常規(guī)品種B

6、Y中腸組織克隆BmTret1-like基因，擴(kuò)增得到1272bp片段。將該基因與家蠶基因組中的同源序列比較可以看出其同源基因在染色體中分布并不均勻，主要分布在27連鎖群上的最多。將該基因與其他物種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)可以看出BmTret1-like基因與白紋伊蚊、火紅蟻、紅鰭東方鲀及意蜂親緣關(guān)系較近，與黑腹果蠅、秀隱線蟲(chóng)等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。BmTret1-like基因在家蠶各個(gè)組織中均表達(dá)，沒(méi)有表現(xiàn)出組織特異性。在中腸組織中，添加病毒后蠶體內(nèi)Bm

7、Tret1-like基因表達(dá)量都有所下調(diào)；在脂肪體組織中，添加病毒后蠶體內(nèi)BmTret1-like基因在抗性品種和非抗品種中表現(xiàn)出不同的調(diào)節(jié)趨勢(shì)，在非抗性品種中除12h時(shí)間點(diǎn)外均表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)，而抗性品種中都表現(xiàn)出下調(diào)趨勢(shì)。
　　3、利用RNAi實(shí)驗(yàn)初步探索BmTret1-like基因功能
　　根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)合成BmTret1-like基因的dsRNA，用帶有熒光基團(tuán)的BV病毒穿刺抗性品種及常規(guī)品種，其中抗性品種一組注射d