Bmo-let-7在家蠶化蛹過(guò)程中的功能研究.pdf

1、昆蟲(chóng)是種類最豐富的種群,與人類生產(chǎn)、生活密切相關(guān)。昆蟲(chóng)的發(fā)育是昆蟲(chóng)研究中的重要研究領(lǐng)域。昆蟲(chóng)分為不完全變態(tài)昆蟲(chóng)和完全變態(tài)昆蟲(chóng)。完全變態(tài)昆蟲(chóng)的外形和生理特點(diǎn)在生命周期各個(gè)階段都有很大差異。家蠶是完全變態(tài)昆蟲(chóng),一生經(jīng)歷卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)四個(gè)階段.這些不同階段的時(shí)序發(fā)育機(jī)制還不清楚。作為重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)和鱗翅目的模式生物,對(duì)家蠶發(fā)育調(diào)控的研究在蠶桑產(chǎn)業(yè)和鱗翅目害蟲(chóng)防治方面都有著十分重要的意義。
　　 Let-7是首先發(fā)現(xiàn)的microRN

2、As之一,在線蟲(chóng)、果蠅、斑馬魚(yú)、人類等許多物種中都高度保守。家蠶中首先被實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的microRNA也是let-7。Let-7在家蠶中的表達(dá)與在其他物種中的表達(dá)模式類似,都高量表達(dá)于個(gè)體發(fā)育后期。本文著重探究了let-7是否調(diào)控家蠶幼蟲(chóng)到蛹的發(fā)育過(guò)程,并對(duì)其靶基因進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　 Let-7表達(dá)量改變后,家蠶的化蛹過(guò)程受到影響。Let-7表達(dá)量提高后家蠶化蛹過(guò)程受到抑制。Let-7具有抑制細(xì)胞分裂,促進(jìn)分化和成熟的作用;而R

3、as激活突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的分裂更加旺盛。Let-7有可能是通過(guò)抑制Ras來(lái)發(fā)揮其功能。
　　 1.改變let-7表達(dá)量對(duì)家蠶化蛹的影響
　　 家蠶從幼蟲(chóng)到蛹的轉(zhuǎn)變要經(jīng)歷一個(gè)過(guò)渡時(shí)期,即預(yù)蛹期。在預(yù)蛹期上調(diào)let-7將阻礙家蠶化蛹,而一定程度下調(diào)并不影響家蠶化蛹。陰性對(duì)照、突變let-7的種子堿基都不會(huì)影響家蠶化蛹。綜合以上實(shí)驗(yàn)證明是let-7上調(diào)導(dǎo)致家蠶不能化蛹。
　　 2.檢測(cè)let-7及RasmRNA表達(dá)

4、>　　 Let-7mimics能夠上調(diào)let-7,而let-7antagomir能夠下調(diào)let-7。Let-7上調(diào)水平隨let-7mimics劑量提高而上升。Let-7表達(dá)變化并不明顯改變Ras的轉(zhuǎn)錄水平。
　　 3.檢測(cè)Ras蛋白豐度
　　 克隆Ras基因編碼區(qū),原核表達(dá),純化后制備多克隆抗體。改變Let-7表達(dá)量后檢測(cè)Ras蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)let-7上調(diào)后Ras2和Ras3蛋白含量有所降低,Rasl蛋白含量沒(méi)有明顯

5、變化。由此表明Ras2和Ras3可能是let-7的靶基因。
　　 4.驗(yàn)證Ras3'UTR的let-7結(jié)合位點(diǎn)
　　 MicroRNAs調(diào)控靶基岡可以通過(guò)兩種方式:直接結(jié)合靶位點(diǎn)或通過(guò)其他基因間接調(diào)控靶基因。MicroRNAs通常是與靶基因3'UTR上的靶位點(diǎn)相結(jié)合米調(diào)控靶基因表達(dá)。通過(guò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)let-7在Ras1、Ras2和Ras3的3'UTR上分別有2個(gè)、2個(gè)和5個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。
　　 連有Ras23'UTR的熒