Ⅰ型單純皰疹病毒感染內(nèi)耳神經(jīng)元的體外實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分Ⅰ型單純皰疹病毒感染螺旋神經(jīng)元的體外實驗研究
  目的:建立Ⅰ型單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus-1,HSV-1)在體外螺旋神經(jīng)元培養(yǎng)體系中的裂解性感染(lytic infection)模型及潛伏感染(latentinfection)再激活(Viral reactivation)模型。
  方法:出生4-6天的Sprague-Dawley大鼠,解剖出蝸軸,進行消化分離后種植于96孔板內(nèi)。一部分神

2、經(jīng)元培養(yǎng)4天后直接加入表達內(nèi)源性綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的低滴度HSV-1,形成裂解性感染,相差顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞形態(tài)變化和GFP表達情況;另一部分培養(yǎng)的神經(jīng)元在第二天加入含有阿昔洛韋(Acyclovir, ACV)的培養(yǎng)液,第4天加入HSV-1后并繼續(xù)培養(yǎng)于含有ACV的培養(yǎng)液中,形成潛伏感染,第8天撤去ACV,將培養(yǎng)液換成含有曲古抑菌素(Trichostatin

3、A,TSA)的培養(yǎng)液,熒光顯微鏡下每日觀察GFP表達情況,計數(shù)呈GFP陽性的96孔板的孔數(shù)。搜集裂解性感染模型及潛伏感染模型的細胞上清液及細胞,TCID50方法檢測病毒滴度;并采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測不同感染狀態(tài)的特異性標(biāo)志物ICP27、LAT的表達情況。
  結(jié)果:HSV-1直接加入螺旋神經(jīng)元培養(yǎng)體系后可以形成裂解性感染,表現(xiàn)為細胞變圓、壞死,從瓶壁脫落,熒光顯微鏡下可見大量GFP的形成,TCID50方法可以檢

4、測到培養(yǎng)液內(nèi)高滴度的具有感染性的子代病毒,RT-PCR能檢測到裂解性感染的轉(zhuǎn)錄物ICP27和潛伏感染的特異性轉(zhuǎn)錄物L(fēng)AT;培養(yǎng)液中加入ACV后病毒能在神經(jīng)元內(nèi)形成潛伏感染,此時熒光顯微鏡下觀察不到GFP,TCID50也檢測不到子代病毒的形成,RT-PCR只能檢測潛伏感染的特異性標(biāo)志物L(fēng)AT;加入激活劑TSA后潛伏感染的病毒可以被再激活,表現(xiàn)為熒光顯微鏡下再次出現(xiàn)GFP,培養(yǎng)體系內(nèi)細胞發(fā)生病變效應(yīng),TCID50能檢測到子代病毒的形成。

5、r>  結(jié)論:HSV-1能在體外螺旋神經(jīng)元培訓(xùn)體系內(nèi)形成裂解性感染和潛伏感染兩種感染狀態(tài),潛伏感染在激活劑的作用下能轉(zhuǎn)化成裂解性感染。
  第二部分非甾體消炎藥對Ⅰ型單純皰疹病毒感染體外培養(yǎng)前庭神經(jīng)元的影響
  目的:建立HSV-1在體外前庭神經(jīng)元培養(yǎng)體系中的裂解性感染及潛伏感染再激活模型,觀察非甾體消炎藥(Non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)吲哚美辛及西樂葆對HSV-1

6、裂解性感染及潛伏感染再激活的影響
  方法:出生4-6天的Sprague-Dawley大鼠,解剖出前庭神經(jīng)節(jié),進行消化分離后種植于96孔板內(nèi)。首先向前庭神經(jīng)元培養(yǎng)體系中加入病毒后,在不同時間點用實時定量PCR方法和Western blot方法檢測培養(yǎng)體系中環(huán)氧化酶(Cycloxygenase,COX)基因轉(zhuǎn)錄物和蛋白的表達情況;接著向一部分前庭神經(jīng)元培養(yǎng)體系中直接加入低滴度HSV-1和不同濃度梯度的吲哚美辛、西樂葆或前列腺素E2(

7、PGE2),不同時間點搜集病毒和細胞懸液,TCID50檢測病毒滴度,與不加藥物組的病毒滴度進行比較;向另一部分前庭神經(jīng)元培養(yǎng)體系內(nèi)添加ACV使HSV-1形成潛伏感染后,用TSA激活的同時加入吲哚美辛,熒光顯微鏡下每日觀察GFP表達情況,計數(shù)呈GFP陽性的96孔板的孔數(shù),計算激活率,比較加與不加吲哚美辛情況下GFP出現(xiàn)的陽性孔率的區(qū)別,并用TCID50方法檢測兩種狀態(tài)時病毒滴度的差異。同時RT-PCR方法檢測不同感染狀態(tài)下的特異性標(biāo)志物I

8、CP27、LAT的表達情況。
  結(jié)果:COX-1主要表達于前庭神經(jīng)元的胞核,COX-2主要表達于胞漿內(nèi);向前庭神經(jīng)元培養(yǎng)體系中加入病毒后,能誘導(dǎo)COX的表達,加入HSV-1后8小時,COX-2基因轉(zhuǎn)錄物的表達達到高峰,是對照組的14倍,而COX-1表達水平無明顯變化;吲哚美辛和西樂葆能抑制前庭神經(jīng)元培養(yǎng)體系內(nèi)HSV-1的復(fù)制,但這種抑制作用呈濃度依賴性,100μmol/L的吲哚美辛作用48小時可以使病毒滴度降低10倍,而15μm

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