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文檔簡介
1、目的：通過沉默非小細(xì)胞肺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP細(xì)胞中的TRIM25基因，抑制E3泛素蛋白連結(jié)酶TRIM25表達(dá)，探討TRIM25對A549/DDP細(xì)胞株藥物敏感性、早期凋亡率，以及對腫瘤代謝中的關(guān)鍵酶---PKM2表達(dá)的影響，以期為腫瘤耐藥研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法：設(shè)計(jì)并合成針對TRIM25基因的特異性小干擾RNA(siRNA)片段，整合到質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞。采用半定量PCR、定量PCR評價(jià)TRIM2
2、5基因沉默后對A549/DDP細(xì)胞TRIM25基因表達(dá)水平的影響；通過westernblot技術(shù)檢測TRIM25蛋白表達(dá)水平的影響；利用MTT實(shí)驗(yàn)和流式凋亡實(shí)驗(yàn)分別評價(jià)A549/DDP細(xì)胞在順鉑作用下耐藥性和凋亡等生物學(xué)功能；采用免疫熒光技術(shù)、westernblot技術(shù)同時(shí)檢測TRIM25與PKM2的蛋白表達(dá)量。
結(jié)果：1、轉(zhuǎn)染TRIM25siRNA后，半定量PCR、定量PCR結(jié)果一致，mRNA水平顯著下降,尤其是siRNA干
3、擾片段pGPU6-524mRNA水平顯著下降，表達(dá)率為10.8％。westernblot結(jié)果與定量PCR有相同趨勢，實(shí)驗(yàn)組的TRIM25蛋白表達(dá)量下降，其中以pGPU6-524最為明顯。根據(jù)上述結(jié)果，選取干擾片段pGPU6-524進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。
2、抑制A549/DDP細(xì)胞中TRIM25的表達(dá)，A549/DDP細(xì)胞耐藥指數(shù)（RI）下降為7.38，提高了其對順鉑的敏感性，同時(shí)上調(diào)了該細(xì)胞的早期凋亡率。
3、免疫熒光
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