STAT3在斑馬魚側(cè)線毛細胞順鉑損傷中的表達及意義.pdf

1、已知魚類內(nèi)耳突變基因中約1/3與人類綜合征性和非綜合征性耳聾有關(guān)。斑馬魚(zebrafish)作為一種重要的脊椎動物模式生物，雖然沒有外耳和中耳，但具有脊椎動物典型的內(nèi)耳結(jié)構(gòu)，其內(nèi)耳毛細胞組織形態(tài)和分子構(gòu)成均與哺乳動物內(nèi)耳毛細胞極為相似[1]。
　　順鉑為第一代臨床化療鉑類藥物之一，在治療鼻咽癌等頭頸部惡性腫瘤中發(fā)揮著重要作用[2]。然而順鉑在治療腫瘤的同時，也會對機體產(chǎn)生不同程度的毒副作用。據(jù)報道接受順鉑化療的惡性腫瘤患者中，約

2、93％出現(xiàn)漸進性或不可逆性感音神經(jīng)性聾，嚴重影響患者生活質(zhì)量。
　　STAT3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子家族家族(STATs)中重要的一員，它是一種脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白，具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，是JAK-STAT信號通路的重要環(huán)節(jié)[5]。正常組織細胞中，STAT3主要參與細胞的增殖、分化和凋亡等過程。生長因子、細胞因子等多肽類配體在細胞表面與相應(yīng)的受體結(jié)合，受體在胞漿內(nèi)與受體型酪氨酸蛋白激酶JAKs相結(jié)合，受體上的酪氨酸殘基磷酸

3、化并使使JAKs活化;活化的JAKs和受體募集細胞漿內(nèi)的STAT3，并激活STAT3。
　　目的:
　　建立幼年斑馬魚側(cè)線毛細胞順鉑損傷模型;研究STAT3在幼年斑馬魚側(cè)線毛細胞順鉑損傷中的作用。
　　方法:
　　1.順鉑損傷幼年斑馬魚側(cè)線毛細胞及損傷后毛細胞數(shù)量和凋亡信號檢測
　　1.1 順鉑處理受精后第5天(5dpf) AB品系斑馬魚
　　用系統(tǒng)水將順鉑粉末溶解至3333uM，-20℃儲存。取受精

4、后第5天(5dpf)AB品系幼年斑馬魚，隨機分為系統(tǒng)水對照組、不同濃度(125uM、250uM、500uM、750uM、1000uM)順鉑處理組，分別作用1h，2h，3h，4h，6h。每組7條魚。重復(fù)3次。
　　1.2 幼年斑馬魚側(cè)線毛細胞染色
　　系統(tǒng)水對照組及順鉑處理組分別處理1h，2h，3h，4h，6h后，棄掉處理液，用PBS液清洗，每次5min，共3次。然后置于2uM熒光活性染液Yo-Pro-1中避光染色1h，棄掉Y

5、o-Pro-1熒光活性染液，用PBS液清洗，每次5min，共3次。用0.02％ MESS麻醉后，置于凹面載玻片上，用注射器針頭調(diào)整斑馬魚體位，熒光顯微鏡下觀察、拍照，選擇SO1、SO2、O1、OC1四個固定神經(jīng)丘進行毛細胞計數(shù)。
　　1.3 幼年斑馬魚側(cè)線毛細胞凋亡檢測
　　取受精后第5天(5dpf)AB品系幼年斑馬魚，隨機分為系統(tǒng)水對照組、250uM順鉑處理組，分別處理3h。棄掉處理液，用PBS清洗，每次5min，共3次。

6、然后于TUNEL染液中避光染色1h，棄掉TUNEL染色液，用PBS液清洗，每次5min，共3次。將斑馬魚置于凹面載玻片上，用注射器針頭調(diào)整斑馬魚體位，熒光顯微鏡下觀察、拍照，計數(shù)毛細胞凋亡信號。每組10條。重復(fù)3次。
　　2.中性粒細胞可能參與了順鉑對斑馬魚側(cè)線毛細胞的損傷過程
　　取5dpf轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(lyz∶DsRed)，隨機分為對照組和實驗組。實驗組用250uM順鉑處理3h，對照組加入等量系統(tǒng)水。處理完畢，用系統(tǒng)

7、水清洗。置于2uM YO-Pro-1中避光染色1h，系統(tǒng)水漂洗3次，每次5min。在熒光顯微鏡下觀察。每組10條魚，重復(fù)3次。
　　3.STAT3在幼年斑馬魚側(cè)線毛細胞順鉑損傷中激活
　　3.1 RT-q PCR方法檢測幼年斑馬魚STAT表達（詳細步驟見實驗方法）
　　3.2 原位雜交方法檢測幼年斑馬魚神經(jīng)丘STAT3表達（詳細步驟見實驗方法）。
　　4.N-乙酰半胱氨酸(NAC)減弱順鉑對幼年斑馬魚側(cè)線毛細胞的

8、損傷
　　4.1 N-乙酰半胱氨酸和順鉑聯(lián)合處理5dpfAB品系斑馬魚
　　取5dpf幼年斑馬魚，隨機分為對照組、順鉑處理組和NAC+順鉑處理組，NAC+順鉑處理組先用不同濃度N-乙酰半胱氨酸(NAC)(10uM、50uM、100uM、200uM)處理2h，然后加入250uM順鉑溶液處理3h，順鉑處理組只用250uM順鉑溶液處理3h，對照組加入等量系統(tǒng)水。
　　4.2 斑馬魚側(cè)線毛細胞染色
　　對照組及實驗組分別

9、處理3h后，棄掉處理液，用PBS液清洗，每次5min，共3次。然后于2uM熒光活性染液Yo-Pro-1中避光染色1h，棄掉Yo-Pro-1熒光活性染液，用PBS液清洗，每次5min，共3次。用0.02％ MESS麻醉后，置于凹面載玻片上，調(diào)整斑馬魚體位充分暴露待觀察神經(jīng)丘，熒光顯微鏡下觀察、拍照，選擇SO1、SO2、O1、OC1四個固定神經(jīng)丘進行毛細胞計數(shù)。
　　5.統(tǒng)計學(xué)分析
　　資料分析采用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件，

10、數(shù)據(jù)以均值±標準差（(x)±s）表示，兩因素多水平比較采用重復(fù)測量的方差分析，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，單因素多水平比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊性檢驗采取Levene檢驗，方差齊者用LSD-t法，方差不齊者用Dunnett-t法。設(shè)P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.順鉑損傷幼年斑馬魚側(cè)線毛細胞
　　用順鉑處理后計數(shù)SO1、SO2、O1、OC1四個神經(jīng)丘得出毛細胞均數(shù)。

11、正常斑馬魚側(cè)線這四個神經(jīng)丘毛細胞均數(shù)為10.4167±0.92983;用250uM順鉑處理3h后，計數(shù)毛細胞均數(shù)為5.2381±0.81577;用250uM順鉑處理6h后，計數(shù)毛細胞均數(shù)為0.0357±0.08964;用1000uM順鉑處理3h后，計數(shù)毛細胞均數(shù)為0.5±0.45415;用1000uM順鉑處理6h后，計數(shù)毛細胞均數(shù)為0±0。經(jīng)統(tǒng)計各順鉑處理組的側(cè)線毛細胞數(shù)量均少于正常對照組，且以上處理組與對照組相比，毛細胞數(shù)量的差異均有

12、統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。從數(shù)據(jù)可看出，斑馬魚側(cè)線毛細胞數(shù)量隨順鉑濃度的增加逐漸減少，且順鉑作用時間越長，側(cè)線毛細胞數(shù)量減少越明顯。這說明順鉑對斑馬魚側(cè)線毛細胞的損傷具有濃度和時間依賴性。
　　2.順鉑損傷后幼年斑馬魚側(cè)線毛細胞的凋亡檢測通過TUNEL染色觀察斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細胞凋亡信號，250uM順鉑處理3h后，側(cè)線神經(jīng)丘毛細胞凋亡信號數(shù)為:0.7333±0.14710。對照組神經(jīng)丘毛細胞凋亡信號數(shù)為:0.0883±0.13

13、786。順鉑處理組側(cè)線毛細胞凋亡信號數(shù)大于對照組(P＜0.01)。說明順鉑導(dǎo)致側(cè)線毛細胞損傷可通過細胞凋亡的方式實現(xiàn)。
　　3.中性粒細胞可能參與了順鉑對斑馬魚側(cè)線毛細胞的損傷過程
　　中性粒細胞是由骨髓造血干細胞分化發(fā)育并進入血液、組織中，正常情況下，血液中的中性粒細胞一般附著于血管壁上，另一半隨血液循環(huán)。在機體需要時骨髓中儲備的大量成熟中性粒細胞會立即進入血循環(huán)。在用順鉑處理斑馬魚的過程中，神經(jīng)丘附近有中性粒細胞聚集現(xiàn)象

14、，并且在顯微鏡下觀察數(shù)分鐘，我們觀察到了中性粒細胞向神經(jīng)丘移動的現(xiàn)象;而對照組斑馬魚沒有此現(xiàn)象。
　　由此可推斷，中性粒細胞可能參與了順鉑對斑馬魚側(cè)線毛細胞的損傷過程，但是中性粒細胞在此過程中起到的具體作用有待進一步觀察。
　　4.STAT3在順鉑導(dǎo)致的斑馬魚側(cè)線毛細胞損傷中表達上調(diào)
　　原位雜交結(jié)果顯示:實驗組側(cè)線神經(jīng)丘STAT3信號高于對照組，且順鉑處理3h時信號高于順鉑處理6h時，提示順鉑處理3h時STAT3表達

15、最高。熒光實時定量PCR結(jié)果與原位雜交結(jié)果相符合。STAT3抑制劑S3I-201+順鉑處理組與順鉑處理組的側(cè)線毛細胞數(shù)分別為:3.6364±0.71906，2.25±0.55572，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。然而與系統(tǒng)水對照組的9.3462±0.99759相比，仍明顯減少(P＜0.01)。
　　5.N-乙酰半胱氨酸(NAC)可減弱順鉑對幼年斑馬魚側(cè)線毛細胞的損傷
　　NAC+順鉑聯(lián)合處理組斑馬魚側(cè)線毛細胞數(shù)分別為

16、:4.4±0.5525，5.4531±0.8814，6.0625±1.1893，7.4706±0.4039。順鉑處理組斑馬魚側(cè)線毛細胞數(shù)為:3.5833±0.9885。對照組斑馬魚側(cè)線毛細胞數(shù)為:9.25±0.9843。統(tǒng)計顯示NAC預(yù)處理后再用順鉑處理的斑馬魚側(cè)線毛細胞數(shù)量明顯高于只用順鉑處理的斑馬魚側(cè)線毛細胞數(shù)(P＜0.01)，且隨著N-乙酰半胱氨酸濃度的增加，保護作用越強，推測ROS在順鉑造成的側(cè)線毛細胞損傷中起著重要作用。

17、>　　結(jié)論:
　　1.用浸泡斑馬魚的方法建立斑馬魚側(cè)線毛細胞順鉑損傷模型可行，且順鉑對斑馬魚側(cè)線毛細胞的損傷存在時間和濃度依賴性;順鉑導(dǎo)致斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細胞的死亡可通過細胞凋亡的方式實現(xiàn)。
　　2.中性粒細胞可能參與了順鉑對斑馬魚側(cè)線毛細胞的損傷過程，需進一步觀察中性粒細胞參與該損傷過程的方式，探討中性粒細胞捕獲機制(NETs)是否參與該過程。
　　3.STAT3在順鉑導(dǎo)致的斑馬魚側(cè)線毛細胞損傷中表達上調(diào);抑制ST