新生大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞中ATP囊泡性質(zhì)的研究.pdf

1、第一部分新生大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞原代培養(yǎng)
　　目的：
　　本部分研究旨在建立新生大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)新方法。方法：
　　采用出生1～3天的Sprague-Dawley大鼠，顯微解剖血管紋和螺旋韌帶組織進(jìn)行體外組織培養(yǎng)，3天后采用選擇性胰酶消化法和差數(shù)貼壁法進(jìn)行血管紋緣細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、純化。流式細(xì)胞儀對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行純度鑒定。
　　結(jié)果：
　　血管紋和螺旋韌帶組織塊進(jìn)行體外培養(yǎng)第3天，倒置相差

2、顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)緣細(xì)胞從組織塊周圍逐漸爬出，細(xì)胞為多角形，呈“鋪路石”樣排列。采用選擇性胰酶消化法和差數(shù)貼壁法進(jìn)行血管紋緣細(xì)胞分離、培養(yǎng)及純化后，約第10天可以得到純度較高的緣細(xì)胞，采用CK-18角蛋白抗體標(biāo)記后經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定，細(xì)胞陽性率為85.3%。
　　結(jié)論：
　　采用組織培養(yǎng)結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)的方法，用選擇性胰酶消化法和差數(shù)貼壁法進(jìn)行血管紋緣細(xì)胞純化，可以在10天左右得到純度較高的新生大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞，可用于進(jìn)一步的實(shí)

3、驗(yàn)研究。
　　第二部分新生大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞中ATP囊泡性質(zhì)的研究
　　目的：
　　本部分研究旨在觀察體外原代培養(yǎng)的新生大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞中存在ATP囊泡，證明此囊泡為溶酶體結(jié)構(gòu)。
　　方法：
　　采用出生1～3天的Sprague-Dawley大鼠，進(jìn)行體外血管紋緣細(xì)胞的原代培養(yǎng)。喹丫因/LAMP1、喹丫因/溶酶體探針、Mant-ATP/溶酶體探針分別處理緣細(xì)胞后，采用激光共聚焦顯微鏡觀察。緣細(xì)胞分別用

4、喹丫因、溶酶體探針、線粒體探針染色后各加入200μM甘氨酰-L-苯丙氨酸-?-萘酰胺(glycyl-L-phenylalanine-?-naphthylamide,GPN)或1μM碳酰氰4-（三氟甲氧基）苯腙(p-trifluoromethoxyphenylhydrazone,FCCP)和10μM寡霉素后，激光共聚焦顯微鏡下觀察加藥前后染色顆粒熒光強(qiáng)度的變化。透射電鏡下觀察緣細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和喹丫因染色后的緣細(xì)胞結(jié)構(gòu)及喹丫因標(biāo)記的ATP囊

5、泡。
　　結(jié)果：
　　緣細(xì)胞在喹丫因染色后，激光共聚焦顯微鏡下可見在細(xì)胞質(zhì)中有大量綠色星點(diǎn)狀顆粒。而相同方法處理3T3細(xì)胞后未在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)相同的綠色熒光顆粒。喹丫因與LAMP1的共定位系數(shù)平均為89.8%，喹丫因染色的顆粒也可以被溶酶體探針標(biāo)記，兩者的共定位系數(shù)平均為91.3%，但不能被線粒體探針標(biāo)記。Mant-ATP積聚的囊泡也可以被溶酶體探針染色。用喹丫因、溶酶體探針分別處理緣細(xì)胞30分鐘，在加入200μM GPN后，

6、染色顆粒熒光強(qiáng)度明顯減弱；而用線粒體探針處理緣細(xì)胞，加入GPN后，染色顆粒熒光強(qiáng)度無明顯變化。用喹丫因、溶酶體探針分別處理緣細(xì)胞，在加入1μM FCCP和10μM寡霉素后，染色顆粒熒光強(qiáng)度無明顯減弱，而用線粒體探針處理緣細(xì)胞，加入FCCP和寡霉素后，染色顆粒熒光強(qiáng)度明顯減弱。在透射電鏡下可以觀察到喹丫因標(biāo)記的溶酶體，但喹丫因不能標(biāo)記線粒體。通過透射電鏡還可以觀察到緣細(xì)胞中的很多結(jié)構(gòu)，諸如微絨毛、“Ω”樣凸起、各種有包膜和無包膜的囊泡、線

7、粒體、溶酶體等等。細(xì)胞之間以緊密連接相連。在腔面頂端還發(fā)現(xiàn)胞吐現(xiàn)象。
　　結(jié)論：
　　新生大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞中存在 ATP囊泡，在激光共聚焦顯微鏡和透射電鏡下證實(shí)了此種囊泡為溶酶體結(jié)構(gòu)，推測(cè)其通過溶酶體胞吐作用釋放ATP。
　　第三部分新生大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞ATP釋放實(shí)驗(yàn)
　　目的：
　　本部分研究旨在探討體外原代培養(yǎng)的新生大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞可以釋放ATP。
　　方法：
　　新生大鼠耳蝸血

8、管紋緣細(xì)胞原代培養(yǎng)后，采用不同處理方法，使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞外液中ATP的釋放量。3T3細(xì)胞作為對(duì)照組。每組采用3個(gè)平行復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)4次。200μM GPN處理后，分別記錄加藥前、加藥后5分鐘、10分鐘、15分鐘熒光值。采用SPSS20.0進(jìn)行各組的統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　熒光值和細(xì)胞濃度呈線性相關(guān)。3T3細(xì)胞r12=0.9996,緣細(xì)胞r22=0.9997。各種濃度的緣細(xì)胞中加入200μM GPN5分鐘后，

9、可以測(cè)量到熒光值較3T3細(xì)胞增加25.7%，兩組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01。200μM GPN、1%Triton X-100,10μM毒胡蘿卜素，200μM GPN+5μM毒胡蘿卜素分別處理5分鐘后，緣細(xì)胞中熒光值顯著增加，3T3細(xì)胞中熒光值無增加；各組與3T3細(xì)胞比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01。而5μM毒胡蘿卜素處理5分鐘后再加200μM GPN5分鐘后，緣細(xì)胞中熒光值無顯著增加，與3T3細(xì)胞比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.

10、05。
　　結(jié)論：
　　新生大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞可以釋放ATP，且ATP存在于膜包被的溶酶體結(jié)構(gòu)內(nèi)。
　　第四部分新生大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞ATP釋放機(jī)制的初步實(shí)驗(yàn)
　　目的：
　　本部分研究旨在初步探討體外原代培養(yǎng)的新生大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞釋放ATP的機(jī)制。
　　方法：
　　采用出生1～3天的Sprague-Dawley大鼠，進(jìn)行體外原代血管紋緣細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、純化。采用細(xì)胞免疫染色步驟，緣細(xì)

11、胞分別用AM1-43和LAMP1、AM1-43和EEA1標(biāo)記后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察標(biāo)記物共定位的情況。緣細(xì)胞在2.5μM FM1-43染色后10分鐘，加入200μM GPN后2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘觀察熒光變化情況。
　　結(jié)果：
　　AM1-43和LAMP1共定位，共定位系數(shù)平均為85.7%，而AM1-43和EEA1不共定位。緣細(xì)胞在2.5μM FM1-43染色后10分鐘，加入200μM GPN后2