重組2型腺相關病毒介導錳超氧化物歧化酶高表達對耳蝸血管紋緣細胞氧化損傷保護作用的研究.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分、耳蝸血管紋緣細胞氧化性損傷體外模型的建立 目的: 建立耳蝸血管紋緣細胞(Marginal cells，MCs)氧化性損傷的體外模型。 方法: 體外培養(yǎng)的耳蝸血管紋緣細胞中加入不同濃度的過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)，觀察細胞形態(tài)結構變化；采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法檢測200、300、400、600、800umol/L H2O2

2、作用0.5、1、2、4、16、24h對血管紋緣細胞活性的影響；檢測不同濃度H2O2作用2h血管紋緣細胞脂質過氧化產物丙二醛(Malondial—dehyde，MDA)含量的變化；應用碘化丙錠(Propidium Iodide，PI)染色流式細胞儀測定細胞的凋亡率；采用免疫印跡法（Western blot）檢測凋亡因子Caspase-3活化片段Cleaved-caspase-3的表達。 結果: H2O2作用后血管紋緣細胞出現核固縮

3、、邊緣化,胞漿濃縮,被膜包裹,隆起,產生凋亡；隨著H2O2濃度的增加、H2O2作用時間的延長，緣細胞活性降低；200umol/L的H2O2作用2h，即可誘導緣細胞凋亡率升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Cleaved-caspase-3在正常緣細胞呈微弱表達，H2O2作用后Cleaved-caspase-3表達明顯增強，并隨H2O2濃度的增高而增強，600umol/L組表達開始減弱，800umol/L僅見弱表達。 結論:

4、H2O2可復制耳蝸血管紋緣細胞的氧化性損傷，成功建立緣細胞氧化性損傷的體外模型，Caspase-3的激活參與了緣細胞的氧化損傷過程。 第二部分、重組2型腺相關病毒介導錳超氧化物歧化酶轉染大鼠耳蝸血管紋緣細胞的研究 目的:　探討以重組2型腺相關病毒(Recombinant adeno-associated viruses of the serotypes 2，rAAV2)為載體轉染體外培養(yǎng)的大鼠耳蝸血管紋緣細胞（Margi

5、nal cells，MCs），獲得高表達錳超氧化物歧化酶（Manganese Superoxide Dismutase，MnSOD）轉基因緣細胞的可行性。 方法:　實驗組按感染復數(MOI)為104v.g./cell對體外培養(yǎng)的血管紋緣細胞轉染rAAV2- MnSOD-EGFP，同時設轉染rAAV2-EGFP的緣細胞作為空載對照組，未轉染細胞為空白對照組。熒光顯微鏡下每2d觀察1次MCs的綠色熒光蛋白（Enhenced gree

6、n fluorescent protein，EGFP）表達情況。比色法測定各組MCs的MnSOD活性。激光共聚焦顯微鏡下觀察轉染rAAV2- MnSOD-EGFP后MnSOD的表達，免疫印跡法（Western blot）半定量分析MnSOD的表達水平。 結果:　(1) 各組MCs轉染后，生長正常。空載對照組MCs轉染rAAV2-EGFP后2天開始出現微弱EGFP的表達，1周后至高峰；實驗組轉染rAAV2-MnSOD-EGFP后4

7、d出現EGFP的表達，10d至高峰；且持續(xù)細胞體外生長的整個周期。EGFP的表達在熒光顯微鏡490nm波長激發(fā)光下呈黃綠色，彌漫于整個胞質。(2)根據激光共聚焦顯微鏡及Western blot檢測結果、經過計算，實驗組較空載對照組和空白對照組的MCs中MnSOD的表達明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義。 結論:　rAAV2-MnSOD-EGFP能有效地轉染體外培養(yǎng)的MCs并持續(xù)高表達MnSOD。 第三部分、重組2型腺相關病毒介導

8、錳超氧化物歧化酶高表達對耳蝸血管紋緣細胞氧化損傷的保護作用 目的:　探討以重組2型腺相關病毒（Recombinant adeno-associated viruses of the serotypes 2，AAV2)介導錳超氧化物歧化酶（Manganese superoxide dismutase，MnSOD)高表達對耳蝸血管紋緣細胞氧化損傷的作用及機制。 方法:　體外培養(yǎng)血管紋緣細胞，分為實驗組、對照組及正常組。實驗組

9、按感染復數(MOI)為104v.g./cell轉染rAAV2-MnSOD-EGFP，同時轉染rAAV2-EGFP作對照組及不作處理緣細胞為正常組。熒光顯微鏡下觀察MCs綠色熒光蛋白（Enhenced green fluorescent protein，EGFP）的表達情況及免疫印跡法（Western blot）分析轉染后MnSOD的表達水平。實驗組及對照組同時暴露于400umol/L過氧化氫(Hydrogen peroxide H2O2

10、) 2h，24h后比色法測定各組丙二醛（Malondialdehyde，MDA)含量；流式細胞PI熒光標記檢測細胞凋亡率；Western blot檢測凋亡因子caspase-3活化片段Cleaved caspase-3的表達。 結果:(1) 各組MCs轉染后,生長正常,實驗組轉染rAAV2-MnSOD-EGFP后4d出現EGFP的表達，10d至高峰；且持續(xù)細胞體外生長的整個周期。實驗組MnSOD的表達及活性明顯高與對照組及正常組