刺參糖復(fù)合物的分離純化及其對神經(jīng)前體細(xì)胞作用的初步研究.pdf

1、刺參(Stichopus japonicus)是我國北方唯一的食用海參，主要分布在渤海灣、南至江蘇連云港等周邊海域。目前對于刺參多糖及其復(fù)合物藥理活性的研究主要集中于抗凝血、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等方面，關(guān)于刺參多糖及其復(fù)合物對原代培養(yǎng)的神經(jīng)前體細(xì)胞活性方面，尤其是誘導(dǎo)其去分化方面的報道還較少見。另外多數(shù)研究是以干刺參為原材料，從中提取粗多糖或者進(jìn)行初步的純化，而本實驗則采用鮮活刺參為原材料，從中提取并純化了糖復(fù)合物，這在國內(nèi)外文獻(xiàn)報道中也

2、是較少出現(xiàn)的。 本文以刺參粗提物為材料，研究了它對原代培養(yǎng)的胎鼠神經(jīng)前體細(xì)胞的作用，根據(jù)結(jié)果推測刺參粗提物在神經(jīng)前體細(xì)胞貼壁后可以誘導(dǎo)其發(fā)生去分化。為了確定是何種活性物質(zhì)在起作用，以便進(jìn)一步深入地研究這種活性物質(zhì)及其活性，我們對刺參粗提物進(jìn)行了分離純化和各組分活性跟蹤，得到了HS-1和HS-2兩個糖復(fù)合物活性組分，并對其結(jié)構(gòu)和活性兩方面進(jìn)行了初步研究。本文的主要研究內(nèi)容如下： 1．活性組分的提取和分離純化。采用雙酶解然后

3、醇沉的方法得到刺參粗提物，用大孔吸附樹脂柱脫色，然后用DEAE-Sephrose柱進(jìn)行第一次分離純化，用氯化鈉溶液進(jìn)行線性洗脫，紫外210nm、280nm結(jié)合苯酚硫酸法監(jiān)測流出的各組分，得到A、B、c、D四個糖復(fù)合物組分，然后將其中有活性的組分(組分C、D)分別用Superdex 200柱進(jìn)行第二次分離純化，用0.15mol/L氯化鈉溶液洗脫，紫外210nm和280nm同時監(jiān)測，收集各組分，冷凍干燥，再分別利用Sephadex G-25

4、柱脫鹽，冷凍干燥后進(jìn)行活性檢測，得到兩個糖復(fù)合物活性組分：HS-1和HS-2。 2．刺參糖復(fù)合物HS-1和HS-2的初步結(jié)構(gòu)分析。對HS-1、HS-2進(jìn)行紫外光譜全波長掃描和Superdex 200柱層析分析，結(jié)果表明二者均為均一組分；利用硫酸鋇沉淀的原理對HS-1和HS-2進(jìn)行了硫酸基的定性鑒別，結(jié)果表明二者均含有硫酸基；通過苯酚硫酸法測得．HS-1、HS-2的糖含量分別為63.22﹪和58.90﹪，硫酸咔嘩法測得HS-1、H

5、S-2的己糖醛酸含量分別為38.55﹪和32.29﹪，考馬斯亮藍(lán)法測得HS-1、HS-2中的蛋白含量分別為1.19﹪和1.69﹪： 采用凝膠色譜法測得HS-1、HS-2的分子量分別為631 000Dal和707 900Dal；采用薄層層析和高效液相色譜法測定了HS-1的單糖組成及摩爾比，結(jié)果表明酸解后的HS-1中含有大量巖藻糖和少量半乳糖等其他單糖，巖藻糖和半乳糖的摩爾比為14．29:1；還對HS-1進(jìn)行了紅外光譜和核磁共振分析

6、，根據(jù)結(jié)果推知HS-1的糖苷鍵可能主要為β-型，且HS-1為硫酸化的糖復(fù)合物。 3．刺參糖復(fù)合物HS-1和HS-2對原代培養(yǎng)胎鼠神經(jīng)前體細(xì)胞的作用的初步研究。在原代培養(yǎng)的神經(jīng)前體細(xì)胞貼壁后向其中加入HS-1、HS-2，若干小時后細(xì)胞團(tuán)便呈現(xiàn)出聚團(tuán)現(xiàn)象，且細(xì)胞團(tuán)之間有較粗的連接，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞團(tuán)變得大而致密。濃度梯度試驗結(jié)果表明這種聚團(tuán)現(xiàn)象具有劑量依賴性，隨著刺參糖復(fù)合物濃度的增高，聚團(tuán)所需的時間逐漸縮短。免疫熒光染色結(jié)果顯示貼

7、壁后的神經(jīng)前體細(xì)胞已經(jīng)逐漸分化為神經(jīng)元，但HS-1、HS-2作用10d后的細(xì)胞呈Nestin陽性和NSE弱陽性，即表現(xiàn)出神經(jīng)干細(xì)胞的特征，而此時正常對照組和NGF陽性對照組則表現(xiàn)為Nestin陰性和NSE陽性，即仍然為神經(jīng)元。而且臺盼藍(lán)染色結(jié)果顯示實驗組細(xì)胞團(tuán)絕大部分細(xì)胞仍為活細(xì)胞，因此我們初步推測，在神經(jīng)前體細(xì)胞貼壁后，刺參糖復(fù)合物HS-1和HS-2具有誘導(dǎo)其去分化的作用。另外，利用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)HS-1、HS-2在較低濃度時具有與