Dlx5基因在室管膜前下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律及其對神經(jīng)元分化的影響.pdf

1、研究背景和目的： 神經(jīng)干細(xì)胞(Neuralstemcells，NSCs)是能分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，能自我更新并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞。因此，神經(jīng)干細(xì)胞有可能成為腦組織移植的新型供體源，能較好地解決神經(jīng)移植治療的倫理道德及供體不足等問題，可望成為解決中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能重建和神經(jīng)再生的一條新途徑。此外，也為了解和闡明神經(jīng)發(fā)育機(jī)制提供了有力的證據(jù)。 位于側(cè)腦室附近的室管膜前下區(qū)(Anteriorsubv

2、entricularzone，SVZa)是神經(jīng)干細(xì)胞較為集中的地方之一。從胚胎期至成年階段，此區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)背-腹信號控制下，不斷沿著嘴側(cè)遷移流(Rostralmigratorystream，RMS)向嗅球(Olfactorybulb，OB)遷移，最后在OB分化為中間神經(jīng)元，并成為其終身更新的來源。此區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞具有以下特點(diǎn)：(1)能長距離定向遷移；(2)自產(chǎn)生起即具備發(fā)育為神經(jīng)元的潛能；(3)在遷移過程中始終維持增殖狀態(tài)和神經(jīng)元分

3、化潛能而不進(jìn)一步分化。因此，SVZa神經(jīng)干細(xì)胞成為研究神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移和分化調(diào)控機(jī)制研究的較佳模型，并成為神經(jīng)干細(xì)胞研究的重點(diǎn)。 在SVZa神經(jīng)干細(xì)胞向OB遷移、分化的過程中，需要很多內(nèi)在和外在的因素來共同控制。研究表明，Dlx(distall-lesshomeobox)基因家族中的Dx5基因與OB中間神經(jīng)元的發(fā)育密切相關(guān)。因?yàn)榛蚯贸蟮膶?shí)驗(yàn)表明：Dlx5基因在OB中間神經(jīng)元分化和OB受體神經(jīng)元軸突連接中起著主要作用；是O

4、BSVZ祖細(xì)胞成熟為分離后的局部環(huán)路(中間)神經(jīng)元所必須的；而且只對嗅系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)的神經(jīng)干細(xì)胞的分化進(jìn)行調(diào)節(jié)，是出生后神經(jīng)發(fā)生必須的基因。因此推測，Dlx5基因在SVZa神經(jīng)干細(xì)胞向OB定向遷移及分化的過程中起著重要的作用，但上述研究對Dlx5基因的作用及其機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。本研究以SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的遷移、分化模型為基礎(chǔ)，以體外培養(yǎng)的新生大鼠SVZa神經(jīng)干細(xì)胞為研究對象，通過基因轉(zhuǎn)染等方法研究Dlx5基因在SVZa神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律

5、及其對神經(jīng)元分化的影響，這方面的研究鮮見報(bào)道。 方法： 1.運(yùn)用DNA重組技術(shù)，將小鼠Dx5基因(mDx5)從原核表達(dá)質(zhì)粒上用內(nèi)切酶消化下來，插入到EGFP質(zhì)粒C-末端的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建一個(gè)可以用于真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的Dx5重組質(zhì)粒，并通過雙酶切及DNA測序來鑒定。 2.通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測Dlx5、Er81、Islet1蛋白在生后0天及7天大鼠SVZa、RMS和OB中的表達(dá)情況，以了解SVZa細(xì)胞的分子生物

6、學(xué)特性和表型，以及它們與神經(jīng)干細(xì)胞遷移分化的關(guān)系。 3.運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對SVZa神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行分離、增殖、傳代培養(yǎng)，用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法對其干細(xì)胞特性及分化潛能進(jìn)行鑒定；還用Dlx5、Er81、Islet1抗體聯(lián)合檢其蛋白在SVZa及紋狀體來源的神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)情況，以比較不同部位來源的神經(jīng)干細(xì)胞中這些分子特性及表型的異同。 4.通過基因轉(zhuǎn)染、RT-PCR、WesternBlot等方法研究重組質(zhì)粒在SVZa神經(jīng)干細(xì)

7、胞中的表達(dá)情況； 5.運(yùn)用活體熒光標(biāo)記，詳細(xì)研究基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞分化后的形態(tài)特征，并用免疫熒光雙標(biāo)確定分化細(xì)胞的類型，以了解Dlx5基因轉(zhuǎn)染與神經(jīng)元分化的關(guān)系。 6.提取每一代SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的總RNA，用RT-PCR檢測其內(nèi)源性Dlx5mRNA的表達(dá)情況，并用不表達(dá)內(nèi)源性Dlx5mRNA的細(xì)胞進(jìn)一步研究：用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該代神經(jīng)干細(xì)胞，了解外源轉(zhuǎn)染基因mRNA的表達(dá)情況，同時(shí)了解其內(nèi)源性Dlx5mRNA的變化情況；用BMP

8、-2處理該代神經(jīng)干細(xì)胞24小時(shí)后，用同樣的方法了解內(nèi)源性Dlx5mRNA的變化情況。 7.最后，分別將傳代后，還表達(dá)內(nèi)源性Dlx5mRNA代次的神經(jīng)干細(xì)胞；繼續(xù)傳代后不再表達(dá)內(nèi)源性Dlx5mRNA的神經(jīng)干細(xì)胞；基因轉(zhuǎn)染已不再表達(dá)內(nèi)源性Dlx5mRNA的該代神經(jīng)干細(xì)胞；BMP-2處理已不再表達(dá)內(nèi)源性Dlx5mRNA的該代神經(jīng)干細(xì)胞分化后，用流式細(xì)胞儀檢測它們的神經(jīng)元分化比例。 結(jié)果： 1.新構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pE

9、GFP-mDlx5，經(jīng)過雙酶切后分別產(chǎn)生了一個(gè)780bp的mDx5基因插入片段及4680bp的EGFP載體片段，大小與預(yù)期結(jié)果相符；測序后，將序列在GeneBank中用Blast軟件進(jìn)行同源性比對，結(jié)果，780bp插入片段與已知小鼠Dlx5基因的同源性為100％，而且開放閱讀框沒有移位； 2.Dlx5、Er81蛋白主要定位于細(xì)胞核，胞漿內(nèi)也存在。Er81蛋白分布比較廣泛，在新生大鼠很多腦區(qū)都有表達(dá)，包括OB、RMS、SVZa、紋

10、狀體、海馬、大腦皮層下等；除紋狀體外，Dlx5蛋白也在上述腦區(qū)中表達(dá)；Dlx5及Er81蛋白在生后0天及7天大鼠SVZa、RMS、OB中表達(dá)都比較強(qiáng)，而且，分布的區(qū)域相似，呈重疊表達(dá)的方式，在OB主要分布于顆粒細(xì)胞層和球周細(xì)胞層。Islet1蛋白不在SVZa、RMS、OB中表達(dá)，主要存在于紋狀體，在大腦皮層下也能檢測到。 3.體外培養(yǎng)的SVZa來源的神經(jīng)球細(xì)胞通過鑒定，干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin陽性，而且能分化成神經(jīng)系統(tǒng)三種譜系的

11、細(xì)胞，還具有Dlx5、Er81蛋白陽性，Islet1蛋白陰性的分子生物學(xué)特性和表型，而紋狀體來源的神經(jīng)球細(xì)胞則是Er81、Islet1蛋白陽性，Dlx5蛋白陰性的。 4.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SVZa神經(jīng)干細(xì)胞后，4小時(shí)開始出現(xiàn)綠色熒光，8小時(shí)后增多明顯，24到48小時(shí)達(dá)高峰，并持續(xù)較長時(shí)間。24小時(shí)后RT-PCR檢測到外源轉(zhuǎn)染基因的mRNA表達(dá)，WesternBlot檢測到58KD目的蛋白表達(dá)。表明pEGFP-mDlx5能在SVZa神經(jīng)

12、干細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，是一個(gè)有用的工具； 5.通過活體熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，基因轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞都分化成了有突起的細(xì)胞，其形態(tài)特點(diǎn)主要有兩種：只有兩條突起，分別向相反方向伸長，形成兩個(gè)極；有一很長的、分支較少的突起，類似軸突，而其他突起短、細(xì)，有分支。經(jīng)過NSE雙標(biāo)證實(shí)，這些細(xì)胞為神經(jīng)元樣細(xì)胞。 6.常規(guī)傳代培養(yǎng)下，SVZa神經(jīng)干細(xì)胞中內(nèi)源性Dlx5基因mRNA表達(dá)具有一定的規(guī)律性：在第1至第3代時(shí)，RT-PCR能檢測到內(nèi)源性Dlx5

13、mRNA表達(dá)，繼續(xù)傳代至第4代時(shí)，表達(dá)消失；不過，這種改變是可逆的，用Dlx5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染第4代細(xì)胞后24小時(shí)，不但外源轉(zhuǎn)染基因mRNA有表達(dá)，內(nèi)源性Dlx5基因mRNA也恢復(fù)了表達(dá)；用100ng/ml的BMP-2處理第4代細(xì)胞后24小時(shí)，內(nèi)源性Dlx5基因也能重新出現(xiàn)。 7.相應(yīng)地，上述四種Dlx5mRNA表達(dá)狀態(tài)的神經(jīng)干細(xì)胞分化后，用FCM檢測到的神經(jīng)元比例分別為：19.16±0.75％；8.34±0.36％；35.66±0

14、.58％；22.27±0.12％。單因素方差分析表明：各組間兩兩比較，神經(jīng)元分化比例均有顯著差異，P＜0.05。 結(jié)論： 1.聯(lián)合檢測SVZa神經(jīng)干細(xì)胞中Dlx5、Er81、Islet1蛋白表達(dá)能區(qū)別其它部位如紋狀體來源的神經(jīng)干細(xì)胞，Dlx5、Er81蛋白表達(dá)陽性，Islet1蛋白陰性是SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的分子特性和表型之一； 2.常規(guī)體外培養(yǎng)的SVZa神經(jīng)干細(xì)胞中，內(nèi)源性Dlx5基因mRNA表達(dá)具有一定的規(guī)律性