外胚層間充質(zhì)來源的神經(jīng)干細(xì)胞-纖維蛋白支架復(fù)合體移植修復(fù)大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察大鼠鼻呼吸黏膜固有層內(nèi)的外胚層間充質(zhì)干細(xì)胞來源的神經(jīng)干細(xì)胞在纖維蛋白支架中的增殖、分化情況，并評價外胚層間充質(zhì)來源的神經(jīng)干細(xì)胞-纖維蛋白支架復(fù)合體移植修復(fù)大鼠脊髓急性橫斷性損傷的療效。
　　方法：
　　（1）獲得SD大鼠活體鼻呼吸黏膜固有層組織，于體外培養(yǎng)，利用反復(fù)貼壁細(xì)純化法對組織內(nèi)的外胚層間充質(zhì)干細(xì)胞（ectomesenchymal stem cells, EMSCs）進(jìn)行純化，并在體外對其進(jìn)行擴(kuò)增。用神經(jīng)干細(xì)

2、胞（neural stem cells, NSCs）誘導(dǎo)培養(yǎng)基將純化增殖后的EMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，使其成為類神經(jīng)干細(xì)胞。
　?。?）EMSCs源NSCs于纖維蛋白膠鋪底的24孔板/6孔板中培養(yǎng)（作為F-N組），同時設(shè)置對照組（Control組），除不用纖維蛋白膠鋪底外，其余培養(yǎng)條件均相同。2周后對兩組細(xì)胞行免疫熒光染色，觀察其生長、分化情況，并利用Western blot技術(shù)評價分析兩組細(xì)胞的神經(jīng)絲蛋白200（NF200）以及神

3、經(jīng)生長相關(guān)蛋白43（GAP43）的表達(dá)水平并做比較。
　?。?）制作大鼠脊髓T10段橫斷模型，SD大鼠（清潔級）60只隨機(jī)分為三組：EMSCs源NSCs-纖維蛋白支架復(fù)合體移植組（作為N-F組）、纖維蛋白支架移植組（Fg組）和單純手術(shù)組（SCI組）。術(shù)后每周對大鼠行雙盲Basso Beattie Bresnahan（BBB）評分，并于移植術(shù)后12周獲取斷端脊髓組織標(biāo)本，免疫組織化學(xué)染色觀察再生情況，并利用Western blot技

4、術(shù)檢測脊髓橫斷部位標(biāo)本的GAP43、NF200、突觸蛋白（synapsin）的表達(dá)水平，三組間進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：
　?。?）鼻呼吸黏膜固有層組織可純化培養(yǎng)出EMSCs，并且其可在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，免疫熒光顯示其CD105、CD44、nestin、vimentin等標(biāo)志蛋白陽性。EMSCs源NSCs在體外擴(kuò)增良好，免疫熒光染色結(jié)果顯示其具有明顯的神經(jīng)干細(xì)胞表型（高表達(dá) nestin、CD133）。
　?。?）F-N組E

5、MSCs源NSCs球在纖維蛋白膠內(nèi)生長良好，并可分化為類神經(jīng)元細(xì)胞，細(xì)胞向周圍空間發(fā)出突起，且突起間結(jié)構(gòu)相互聯(lián)系。與對照組相比，免疫熒光顯示其分化出的類神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量多，突起相對較長，突起間連接更復(fù)雜。Western blot結(jié)果顯示NF200、GAP43表達(dá)水平兩組有顯著差異（P<0.05）。
　?。?）BBB評分顯示，從術(shù)后2周開始至12周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，N-F組BBB評分每周均高于Fg組和SCI組，并且統(tǒng)計學(xué)差異顯著（p<0.05

6、）。Fg組動物運(yùn)動功能也有所改善，但程度有限。SCI組動物運(yùn)動功能幾乎無改善。Western blot技術(shù)檢測顯示N-F組動物脊髓標(biāo)本NF200、GAP43、synapsin相對表達(dá)量均高于Fg組和SCI組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。脊髓組織切片免疫組化顯示脊髓斷端 N-F組可見大量陽性神經(jīng)纖維呈網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，并伸入斷端兩側(cè)脊髓實(shí)質(zhì)；Fg組有較少量纖維通過，但不成網(wǎng)絡(luò)；SCI組斷端組織破潰，幾乎沒有陽性纖維通過。
　　結(jié)論