腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩的產(chǎn)生及其調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：腎小球(glomerulus)阻力增加能夠引起腎小球?yàn)V過率(GFR)降低和腎小球硬化的進(jìn)展，部分原因是由于腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cells，GMCs)收縮導(dǎo)致的．眾所周知GMCs的收縮由細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化調(diào)節(jié)。目前隨著新技術(shù)的發(fā)展(共聚焦顯微鏡技術(shù))，對胞內(nèi)鈣離子信號的研究從胞漿內(nèi)總體鈣濃度的變化研究過渡到微觀細(xì)胞內(nèi)鈣波(calcium waves)、鈣振蕩(calcium oscil

2、lations)和鈣火花(calcium sparks)的生物學(xué)效應(yīng)的探討．我們研究發(fā)現(xiàn)GMCs在外界刺激的情況下能夠產(chǎn)生持續(xù)的細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩，但是GMCs內(nèi)鈣振蕩在外界刺激下是如何產(chǎn)生的，是否鈣振蕩的產(chǎn)生及變化能夠引起GMCs收縮，以及刺激物通過哪種鈣振蕩方式(頻率方式、幅度方式)調(diào)節(jié)收縮，仍需要進(jìn)一步探討。 方法：實(shí)驗(yàn)采用原代培養(yǎng)的3月齡，28月齡雄性Wistar大鼠(每組n=8)系膜細(xì)胞；種于35mm共聚焦專用培養(yǎng)皿(Gla

3、ss Bottom Microwell Dishes)中，用鈣離子熒光探針Fluo-3標(biāo)記細(xì)胞，共聚焦顯微鏡60×油鏡下觀察不同濃度血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)刺激產(chǎn)生的GMCs胞內(nèi)鈣振蕩的變化。同時(shí)分別加入不同鈣離子阻斷劑Thapsigangin(TG)，EGTA，2-aminoethoxydiphenyl borate(2-APB)，Ryanodine和1-0-octadecyl-2-0- methyl-sn-

4、glycero-3-phospho-rylcholine(ET-18-OCH<,3>)后，觀察GMCs內(nèi)鈣離子振蕩的變化，闡明其產(chǎn)生機(jī)制；通過檢測肌球蛋白輕鏈(MLC<,20>)磷酸化的水平和GMCs平面表面積收縮試驗(yàn)檢測系膜細(xì)胞的收縮情況；通過細(xì)胞間接免疫熒光染色檢測系膜細(xì)胞內(nèi)InsP<,3>受體和Ryanodine受體亞型的表達(dá)及其共定位的情況。 結(jié)果：在單個(gè)GMCs中，AngⅡ能夠誘導(dǎo)典型的鈣離子振蕩，這種鈣振蕩能夠完全被

5、TG，2-APB及ET-18-OCH<,3>抑制，只能被ryanodine部分抑制，在細(xì)胞外鈣缺乏的情況下不能被抑制。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)ryanodine受體和InsP<,3>受體存在很強(qiáng)的共定位現(xiàn)象，起著放大Ca<'2+>信號的作用。在排除了全細(xì)胞Ca<'2+>水平變化的影響后，MLC<,20>。的磷酸化和GMCs的收縮與鈣振蕩有關(guān)。鈣振蕩的頻率調(diào)節(jié)GMCs的收縮，這種作用能夠被KN-93抑制，而衰老相關(guān)的收縮降低卻與振蕩的幅度降低相關(guān)。

6、 結(jié)論：我們的結(jié)果證明，單個(gè)系膜細(xì)胞對AngⅡ引起的鈣離子反映是典型的鈣離子振蕩；鈣振蕩通過PLC-InsP，途徑激活產(chǎn)生，通過后續(xù)激活的ryanodine受體釋放鈣離子放大鈣振蕩信號，最后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵重吸收鈣離子完成一個(gè)鈣振蕩周期；進(jìn)而首次證明鈣振蕩是調(diào)節(jié)GMCs收縮所必須的，在不同濃度的AngⅡ刺激下，鈣振蕩通過頻率依賴的模式(a frequency-dependent mode)調(diào)節(jié)GMCs收縮，而隨細(xì)胞衰老，鈣振蕩幅度(a am