健脾祛濕和絡(luò)方調(diào)控腎小球足細(xì)胞及系膜細(xì)胞的分子機(jī)制研究.pdf

1、第一章:文獻(xiàn)綜述
　　健脾祛濕和絡(luò)方常用于緩解腎病的蛋白尿及血尿，具有減輕腎損害,保護(hù)腎功能的作用。目前關(guān)于腎臟的生理病理研究表明，足細(xì)胞作為高度分化的終末期細(xì)胞，較易受到致病刺激的影響，受損后影響了腎小球?yàn)V過屏障的完整，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生;此外，GMCs受到致病刺激后，會(huì)過度增殖并表達(dá)大量ECM，導(dǎo)致腎小球內(nèi)系膜區(qū)膨脹，擠壓毛細(xì)血管袢影響腎小球正常結(jié)構(gòu)，進(jìn)而引發(fā)血尿和蛋白尿。近年相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明，多種中草藥或中藥復(fù)方對減輕足細(xì)

2、胞、系膜細(xì)胞損傷，緩解腎臟疾病具有顯著作用。故本研究旨在通過探索健脾祛濕和絡(luò)方對腎小球內(nèi)足細(xì)胞及GMCs的作用，構(gòu)建該方臨床療效的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第二章:健脾祛濕和絡(luò)方對損傷足細(xì)胞作用機(jī)制研究
　　研究目的:通過氨基核苷嘌呤霉素(PAN)誘導(dǎo)體外足細(xì)胞損傷。探索健脾祛濕和絡(luò)方含藥血清對損傷模型的相關(guān)標(biāo)志蛋白及mTOR相關(guān)自噬因子表達(dá)的影響。探索健脾祛濕和絡(luò)方對損傷足細(xì)胞的作用機(jī)制。
　　研究方法:(1)健脾祛濕和絡(luò)方及

3、替米沙坦、RAP、激素大鼠灌胃提取含藥血清。(2)用10％FBS+DMEM配成的培養(yǎng)基于細(xì)胞箱內(nèi)培養(yǎng)足細(xì)胞。(3)使用氨基核苷嘌呤霉素(PAN)誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷模型。(4)檢測各組含藥血清對正常足細(xì)胞的毒性后，將含藥血清作用于足細(xì)胞損傷模型，采用CCK-8法，酶標(biāo)儀檢測各組OD值，檢測損傷模型在各組血清作用后的活性變化。(5) western blot法檢測健脾祛濕和絡(luò)方作用于足細(xì)胞模型后，細(xì)胞標(biāo)志蛋白nephrin、podocalyxi

4、n及細(xì)胞內(nèi)mTOR相關(guān)自噬蛋白表達(dá)的水平，以判斷健脾祛濕和絡(luò)方對損傷模型的作用。
　　研究結(jié)果:(1)健脾祛濕和絡(luò)方及對照組的血清對足細(xì)胞無毒副作用;(2)嘌呤氨基核苷(PAN)對足細(xì)胞具有損傷作用，100μg/mlPAN作用下，足細(xì)胞損傷為正常組50％左右，為較為理想的造模藥物濃度;(3)健脾祛濕和絡(luò)方含藥血清作用于損傷足細(xì)胞后，低、中含藥血清組與正常組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，高劑量健脾祛濕和絡(luò)方含藥血清較模型組相比

5、，可減輕足細(xì)胞的損傷(P＜0.05)，高含藥血清組與西藥對照組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);(4)健脾祛濕和絡(luò)方組成藥物防己的提取物——漢防己甲素，其藥量在6.25μg/ml以下對足細(xì)胞無毒性作用，6.25μg/ml以上對足細(xì)胞損傷作用明顯(P＜0.05);(5)健脾祛濕和絡(luò)方可改善損傷足細(xì)胞模型的細(xì)胞活性，促進(jìn)足細(xì)胞標(biāo)志蛋白nephrin、podocalyxin的表達(dá)，且安全無毒性;(6) PAN誘導(dǎo)的損傷足細(xì)胞模型內(nèi)mTOR自

6、噬相關(guān)因子明顯激活，其下游蛋白P-P70S6K、P-4EBP1等合成顯著增多，同時(shí)，損傷模型內(nèi)與自噬水平呈正相關(guān)的LC3-Ⅱ含量明顯減少。表明PAN誘導(dǎo)的損傷模型內(nèi)mTOR活性增強(qiáng)且正常的自噬程度降低。健脾祛濕和絡(luò)方高劑量組含藥血清可明顯上調(diào)細(xì)胞模型內(nèi)LC3-Ⅱ表達(dá)，減少mTOR及其相關(guān)因子的合成，改善細(xì)胞內(nèi)降低的自噬水平。且健脾祛濕和絡(luò)方高劑量組與西藥對照組間的差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(p＞0.05)。
　　研究結(jié)論:健脾祛濕和絡(luò)

7、方對PAN誘導(dǎo)的損傷足細(xì)胞有修復(fù)作用。
　　第三章:健脾祛濕和絡(luò)方對增殖GMCs作用研究
　　研究目的:研究健脾祛濕和絡(luò)方對脂多糖(LPS)介導(dǎo)的體外GMCs增殖模型分泌層粘連蛋白、纖維連接蛋白及生長因子TGF-β1的影響。探討健脾祛濕和絡(luò)方臨床可治療慢性腎炎的細(xì)胞作用機(jī)制。
　　研究方法:健脾祛濕和絡(luò)方及對照組藥物給實(shí)驗(yàn)大鼠灌胃后制備各組含藥血清。用10％FBS+DMEM配制培養(yǎng)基于體外培養(yǎng)脂多糖(LPS)介導(dǎo)的增殖

8、GMCs模型。采用酶聯(lián)免疫法吸附試驗(yàn)(ELISA)測定含藥血清作用于增殖的GMCs后，GMCs上清液中細(xì)胞外基質(zhì)主要組成物質(zhì)(LN、FN、TGF-β1)含量。
　　研究結(jié)果:(1) LPS可誘導(dǎo)增殖GMCs大量分泌ECM組成成分，且作用時(shí)間越長，分泌越多;(2)健脾祛濕和絡(luò)方中高劑量含藥血清在24h、48h、72h對LPS誘導(dǎo)的增殖GMCs細(xì)胞上清液中LN、FN、TGF-β1表達(dá)均有抑制作用，差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。且