α-硫辛酸通過mTOR-p70S6K-4E-BP1信號通路調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞功能紊亂.pdf

1、糖尿病腎臟疾病(Diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病的微血管并發(fā)癥之一，目前糖尿病患者腎小球硬化和終末期腎臟疾病患病率仍不斷升高，明顯增加了糖尿病患者人群的死亡率。腎小球硬化是DKD的典型特征，腎小球系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過度生成是DKD腎小球硬化的始動機制。因此，有效抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)積聚對于防治DKD腎小球硬化具有重要意義。
　　α-硫辛酸(LA)作為一種強效抗氧化劑，對葡萄糖和脂

2、代謝發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，還可有效改善糖尿病腎臟肥大和細(xì)胞外基質(zhì)的積聚。但是，LA對高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖影響的研究較少。LA作為一種短鏈脂肪酸，已被證實可激活多種組織細(xì)胞AMP活化的蛋白激酶(AMPK)。研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶(CaMKK)在哺乳動物細(xì)胞中廣泛表達，并作為AMPK的上游激活物。LA通過增加大鼠骨骼肌CaMKK活性，促進AMPK活化并抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/核糖體40S小亞基s6蛋白激

3、酶(p70S6K)信號，進而抑制了蛋白質(zhì)合成，并改善了高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗。近年來研究發(fā)現(xiàn)LA可直接與胰島素受體酪氨酸激酶區(qū)結(jié)合，激活肝細(xì)胞和甲狀腺細(xì)胞蛋白激酶B(Akt)通路。LA還可通過激活A(yù)kt以促進mTOR、p70S6K和4EBP1磷酸化，有效改善腦血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注損傷。這些結(jié)果表明LA可以通過激活A(yù)MPK、Akt調(diào)控組織細(xì)胞mTOR信號通路。
　　mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與組成兩種功能性蛋白復(fù)合物:mT

4、ORC1和mTORC2。mTORC1是由mTOR、mLST8、PRAS40和Raptor形成的蛋白復(fù)合物。mTORC1通過磷酸化其下游的兩個效應(yīng)因子p70S6K及4EBP1對細(xì)胞的生長、增殖和蛋白質(zhì)合成發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。Akt可通過磷酸化抑制TSC2進而間接激活mTOR，導(dǎo)致mTORC1信號增強;同時，Akt還可促進PRAS40磷酸化并減弱其對mTORCl的抑制作用。而AMPK則通過刺激TSC2(Ser1345)磷酸化以間接地抑制mT

5、OR，導(dǎo)致mTORC1信號減弱;AMPK還可刺激Raptor(Ser722和Ser792)發(fā)生磷酸化并促進其對mTORC1的抑制作用。糖尿病時，高血糖通過增加Akt活性并抑制AMPK，間接激活mTORC1。mTORC1激活與糖尿病腎臟病理改變密切相關(guān)，包括細(xì)胞外基質(zhì)增加、腎小球肥大、腎小球基底膜增厚。
　　目的：
　　基于上述研究結(jié)果，本研究將觀察LA對高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖發(fā)揮何種調(diào)節(jié)作用，并探討LA的這一作用是否通

6、過激活A(yù)MPK、Akt進而調(diào)控mTOR/p70S6K/4EBP1信號通路而實現(xiàn)。
　　方法：
　　第一部分 LA對高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞功能紊亂及mTOR/p70S6K/4E-BP1信號蛋白的影響
　　取7～9代對數(shù)生長期HBZY-1大鼠腎小球系膜細(xì)胞，以每孔2×105個細(xì)胞接種6孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞待其貼壁融合70％～80％后用無血清1640培養(yǎng)基同步化過夜，分組處理:(1)正常對照組(NG，含葡萄糖5.5mmol

7、/L);(2)滲透壓對照組(Man，含葡萄糖5.5 mmol/L+甘露醇24.5mmol/L);(3)高糖(HG，含葡萄糖30mmol/L)組;(4)HG+0.1 mmol/L的LA組;(5)HG+0.25mmol/L的LA組;(6)HG+0.5 mmol/L的LA組;(7)HG+0.75 mmol/L的LA組;(8)HG+1.0mmol/L的LA組。培養(yǎng)12、24、48 h后收集各組細(xì)胞。
　　應(yīng)用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖;運用

8、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期;Elisa法檢測細(xì)胞上清液中Fibronectin和Collagen-Ⅰ的表達;實時定量PCR和/或western-blot技術(shù)檢測各組細(xì)胞AMPKα、Akt、mTOR、4EBP1、p70S6K蛋白表達及活性。
　　第二部分 LA調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞功能及mTOR/p70S6K/4E-BP1信號通路的分子機制
　　基于以上實驗篩選出LA對大鼠腎小球系膜細(xì)胞mTOR/p70S6K/4E-BP

9、1信號激活最顯著的濃度A。應(yīng)用LY294002抑制AKT活性，觀察該濃度LA對高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞的影響?；谝陨蠈嶒灪Y選出LA對大鼠腎小球系膜細(xì)胞mTOP/p70S6K/4E-BP1信號抑制作用最顯著的濃度B。應(yīng)用STO-609抑制AMPK活性，觀察該LA對高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞的影響。
　　待傳代培養(yǎng)的細(xì)胞在6孔板中貼壁融合70％～80％后，用無血清1640培養(yǎng)基同步化過夜，分組如下:①正常對照組(NG，含葡萄糖

10、5.5mmol/L);②滲透壓對照組（Man，含葡萄糖5.5mmol/L+甘露醇24.5mmol/L）;③高糖（HG，含葡萄糖30mmol/L）組;④HG+LA(A)組;⑤HG+LA(A)+LY294002(2.5μmol/L)組;⑥HG+LA(A)+LY294002(5μnol/L)組;⑦HG+LA(A)+LY294002(10μmol/L)組;⑧HG+LA(B);⑨HG-+LA(B)+STO-609(2.5μg/ml);⑩HG+LA

11、(B)+STO-609(5μg/ml);(11)HG+LA(B)+STO-609（10μg/ml）。培養(yǎng)12h、24h、48h后收集各組細(xì)胞，用于后續(xù)實驗。應(yīng)用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖;運用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期;Elisa法檢測細(xì)胞上清液中Fibronectin和Collagen-Ⅰ的表達;實時定量PCR和/或Western-blot技術(shù)檢測各組細(xì)胞AMPKα、Akt、rmTOR、4EBP1、p70S6K蛋白表達及活性。
　　結(jié)

12、果：
　　第一部分 LA對高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞功能及Akt、AMPK、mTOR蛋白表達的影響
　　(1)相對低濃度LA對高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞功能的影響與NG組比較，HG組細(xì)胞增殖顯著增加，S期細(xì)胞比例升高、G0/G1期細(xì)胞比例下降;HG組細(xì)胞Fibronectin和Collagen-Ⅰ的表達較NG組升高。與HG組比較，HG+0.1 mmol/L LA組和HG+0.25mmol/L LA組細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期G0

13、/G1→S進展增加;Fibronectin和Collagen-Ⅰ表達也較HG組進一步升高。
　　(2)相對高濃度LA對高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞的影響與HG組比較，LA刺激濃度增加至0.5mmol/L以上時，各濃度LA干預(yù)組細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期G0/G1→S進展、Fibronectin和Collagen-Ⅰ表達均被顯著抑制。其中，HG+1.0mmol/L LA組抑制作用最顯著。
　　(3)相對低濃度LA對高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球

14、系膜細(xì)胞Akt、AMPK、mTOR蛋白表達的影響
　　與NG組比較，HG組細(xì)胞AMPKα mRNA表達水平、蛋白磷酸化水平均顯著下降，Akt磷酸化水平顯著升高。與HG組比較，HG+0.1 mmol/L LA組和HG+0.25mmol/L LA組細(xì)胞AMPKα mRNA和AMPKα表達及活性、Akt磷酸化水平升高。
　　與NG組比較，HG組細(xì)胞mTOR、4EBP1和p70S6K蛋白磷酸化水平顯著升高。HG+0.1 mmol/L

15、 LA組和HG+0.25mmol/L LA組細(xì)胞mTOR、4EBP1和P70S6K蛋白磷酸化水平較HG組均顯著上升。其中，HG+0.25mmol/L LA組升高最顯著。
　　(4)相對高濃度LA對高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞Akt、AMPK、mTOR蛋白表達的影響
　　LA刺激濃度大于0.5mmol/L的各LA干預(yù)組中，細(xì)胞Akt磷酸化水平與HG組相比無統(tǒng)計學(xué)差異;而AMPKα mRNA表達、蛋白磷酸化水平隨LA刺激濃度增加

16、呈遞增趨勢。
　　LA刺激濃度超過0.5mmol/L時，mTOR、4EBP1和p70S6K蛋白磷酸化水平呈下降趨勢。其中HG+1.0mmol/L LA組蛋白磷酸化水平顯著低于HG組，與NG組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　第二部分 LA調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞功能及mTOR/p70S6K/4E-BP1信號的分子機制
　　(1)0.25mM LA誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞mTOR/p70S6K/4E-BP1信號激活具有Akt依

17、賴性
　　與HG組比較，HG+0.25mmol/L LA組細(xì)胞AMPKα、Akt、mTOR、4EBP1、p70S6K蛋白磷酸化水平均明顯增加。應(yīng)用PI3K/Akt抑制劑LY294002時，AKT活性顯著下降，HG+0.25mmol/L LA誘導(dǎo)的mTOR、4EBP1、p70S6K蛋白磷酸化激活作用也被解除;但AMPKα蛋白活性較HG+0.25mmol/L LA組無明顯變化。
　　(2)抑制AKT可逆轉(zhuǎn)0.25mM LA誘導(dǎo)的

18、腎小球系膜細(xì)胞功能改變
　　與HG組比較，HG+0.25mmol/L LA組細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期G0/G1→S期進展、Fibronectin和Collagen-Ⅰ表達均明顯升高。應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002抑制Akt后，0.25mmol/L LA的上述作用均被逆轉(zhuǎn)。
　　(3)1.0mM LA誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞mTOR/p70S6K/4E-BP1信號抑制具有AMPK依賴性
　　與HG組比較，HG+1.0mmol/

19、L LA組細(xì)胞AMPKα活性顯著升高，Akt活性無統(tǒng)計學(xué)差異，但mTOR、4EBP1、p70S6K蛋白磷酸化水平均明顯下降。應(yīng)用STO-609抑制CaMKK條件下，1.0mmol/L LA對mTOR、4EBP1、p70S6K蛋白磷酸化抑制作用也被解除。
　　(4) AMPK通路參與調(diào)節(jié)1.0mM LA誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞功能改變
　　與HG組比較，HG+1.0mmol/L LA組細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期G0/G1→S期進展、Fib

20、ronectin和Collagen-Ⅰ表達均被抑制。應(yīng)用CaMKK抑制劑STO-609后，1.0mmol/L LA對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞的上述作用被解除。
　　結(jié)論：
　　1、LA通過同時激活A(yù)MPK、AKT通路調(diào)控高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞mTOR信號通路。相對低濃度硫辛酸對AKT的作用具有優(yōu)勢，可激活mTOR信號;高濃度硫辛酸對AMPK的作用更顯著，可抑制mTOR信號。
　　2、高糖環(huán)境下，體外培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)