二甲雙胍通過AMPK信號(hào)途徑抑制CD19 CAR-T細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性作用并促進(jìn)其凋亡的研究.pdf

1、研究背景：
　　惡性腫瘤已經(jīng)成為危害人類生命健康、降低人們生活質(zhì)量的重要疾病之一，我國(guó)惡性腫瘤每年的發(fā)病率和死亡率均呈上升之勢(shì)，而外科手術(shù)治療、放療和化療等傳統(tǒng)治療方法惡性腫瘤都各有其弊端，治療后都會(huì)對(duì)患者的免疫力產(chǎn)生消極的影響，對(duì)于惡性程度較高、易復(fù)發(fā)且難治的惡性腫瘤缺乏有效的治療方法，因此，尋找一種新型的、有效的治療惡性腫瘤的方法勢(shì)在必行。
　　近年來(lái)，腫瘤細(xì)胞免疫治療越來(lái)越受到科學(xué)家和醫(yī)務(wù)工作者的關(guān)注。腫瘤細(xì)胞免疫治療

2、是一種自體細(xì)胞回輸?shù)倪^繼性免疫細(xì)胞治療手段，通過生物技術(shù)獲取腫瘤患者外周血中免疫細(xì)胞以及對(duì)患者免疫細(xì)胞的體外修飾，重新靜脈回輸至患者體內(nèi)，使機(jī)體重新獲得特異性殺傷惡性腫瘤細(xì)胞的能力。腫瘤細(xì)胞免疫治療最大的優(yōu)勢(shì)就是其安全性和有效性，回輸自體細(xì)胞避免了免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)，免疫修飾使免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞更精確，由此看來(lái)，腫瘤細(xì)胞免疫治療彌補(bǔ)了手術(shù)、化療和放療的缺點(diǎn)，為惡性腫瘤的徹底根治奠定了基礎(chǔ)。抗原嵌合受體(CAR)T細(xì)胞正是基于對(duì)患者外周

3、血T細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，回輸體內(nèi)從而實(shí)現(xiàn)自體細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷功能，因此，CAR-T細(xì)胞免疫治療已經(jīng)成為生物治療領(lǐng)域的關(guān)注重點(diǎn)，為復(fù)發(fā)、難治腫瘤患者帶來(lái)了治愈的希望;基于CD19在B淋巴細(xì)胞表面表達(dá)的特異性，CD19 CAR-T細(xì)胞治療已經(jīng)使不少患者達(dá)到了完全緩解，甚至治愈;但是，B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤并非對(duì)CD19 CAR-T細(xì)胞治療均敏感，如何提高CD19 CAR-T細(xì)胞的治療效果成為很多專家學(xué)者研究的重點(diǎn)。
　　無(wú)論是在內(nèi)

4、分泌疾病還是腫瘤治療領(lǐng)域，糖代謝已經(jīng)成為其疾病發(fā)生發(fā)展中不可忽略的一個(gè)環(huán)節(jié)。目前，有研究表明糖代謝在腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡中也有著舉足輕重的影響。而糖代謝不僅影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，其對(duì)免疫細(xì)胞功能的發(fā)揮也有重要的影響。二甲雙胍，作為Ⅱ型糖尿病一線用藥，在調(diào)節(jié)糖代謝和改善胰島素抵抗方面有著突出的優(yōu)勢(shì)，研究表明，二甲雙胍可以抑制腫瘤細(xì)胞糖代謝，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，起到預(yù)防和治療的目的。然而，二甲雙胍對(duì)于CAR-T細(xì)胞的影響及作用機(jī)制迄

5、今無(wú)人探究，因此，本課題意在研究二甲雙胍對(duì)CD19 CAR-T細(xì)胞的影響，并探討作用機(jī)制。
　　研究目的：
　　研究二甲雙胍對(duì)CD19 CAR-T細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞毒性作用的影響，并探討其作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.采用分子生物學(xué)方法構(gòu)建PGK-EGFP-CD19 CAR慢病毒質(zhì)粒，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行病毒包裝，對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染率;
　　2.CCK-8

6、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法評(píng)估二甲雙胍對(duì)CD19 CAR-T細(xì)胞增殖的影響;
　　3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)二甲雙胍對(duì)CD19 CAR-T細(xì)胞凋亡的影響;
　　4.CD19 CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞按照一定的效靶比(E∶T)共培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀評(píng)估二甲雙胍對(duì)CD19 CAR-T細(xì)胞殺傷能力的影響，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子的釋放;
　　5.Western blotting驗(yàn)證二甲雙胍通過AMPK-mTOR-HIF1α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途

7、徑影響CD19CAR-T細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞毒性作用。
　　研究結(jié)果：
　　1.二甲雙胍抑制CD19 CAR-T細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡;
　　2.二甲雙胍降低CD19 CAR-T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，抑制其細(xì)胞因子的釋放;
　　3.二甲雙胍激活A(yù)MPK，進(jìn)而抑制mTOR的表達(dá)，最終HIF1α表達(dá)下調(diào);
　　4.AMPK抑制劑逆轉(zhuǎn)二甲雙胍的消極作用，但未影響mTOR及HIF1α的表達(dá)，二甲雙胍對(duì)CD19 C